（微生物学专业论文）新型环氧化物水解酶筛选及其在手性合成中的应用.pdf

原创性声明 本人郑重声明 所呈交的学位论文 是本人在导师的指导下 独 立进行研究所取得的成果 除文中已经注明引用的内容外 本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果 对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体 均己在文中以明确方式标明 本人完 全意识到本声明的法律责任由本人承担 论文作者签名 煮 竣2 日期 丝 i 坚 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留 使用学位论文的规定 同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版 允许论 文被查阅和借阅 本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索 可以采用影印 缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文 保密论文在解密后应遵守此规定 论文作者签名 越导师签名 丝日期 之堕 竺望 山东大学博士学位论文 摘要 1 手性环氧化物是有机合成中非常重要的中间体 在医药 农药 铁电液 晶 香料 精细化学品工业上具有极其重要的应用价值 目前已有多种方法用于 手性环氧化物的合成 其中 微生物环氧化物水解酶不需辅酶 来源广泛 而且 对多种类型的底物表现出良好的对映体选择性 因此 利用微生物环氧化物水解 酶将廉价易得的外消旋底物拆分 制备手性环氧化物是非常具有开发潜力的一种 方法 2 用双波长微板法研究了缓冲溶液与细胞悬浮液中吸光度与环氧化物浓度 的关系 通过分析比较发现 在两种体系中回归曲线相互平行 因此 可用缓冲 体系中所测结果绘制标准曲线 计算细胞悬浮液中环氧化物的含量 由此建立了 快速测定混浊体系中环氧化物的方法 在此基础上 环氧化物水解酶活力可以方 便快速的检测 毛细管电泳具有高效 快速 灵敏与低消耗的特点 在手性化合物的分析中 发挥着愈来愈重要的作用 以5 磺酰化b 环糊精为手性选择剂 p h2 5 的2 5 m m o l l 的磷酸缓冲液为背景电解质 建立了高效毛细管电泳检测手性苯基z 醇方法 此方法与双波长平板法检测环氧化水解酶活力相结合 可以方便 快速 地筛选具有高度对映体选择性的环氧化物水解酶产生菌株 3 筛选新型环氧化物水解酶 一直是目前国内外相关研究的重点之一 手 性缩水甘油酸酯类化台物 g l y c i d a t e s 在钙拮抗剂d i l t i a z e m 抗癌药物紫杉醇 侧链 促智药物左旋黄皮酰胺 抗癌药物氨肽酶n 抑制荆b e s t a t i n 等一系列昂贵 的药物合成中具有重要的作用 苯基缩水甘油酸酯类化合物含有极性的羧基并与环氧基团相连 考虑到苯基 缩水甘油酸酯类化合物的这种结构特点 以苯乙烯或苯基环氧乙烷作为模型底物 筛选环氧化物水解酶产生菌株 本文首次筛选到一株细菌b z s 2 1 能对映体选择 性地水解反式一3 苯基缩水甘油酸乙酯 e p g 保留 2 r 3 s 一3 e p g 而且该 山东大学博士学位论文 菌株水解苯基环氧乙烷时生成 苯基7 醇 与已发现的大多数环氧化物水解 酶的对映体选择性互补 另外 筛选到一株黑曲霉h n g 5 能对映体选择性地水 解外消旋苄基缩水甘油醚 b g e 保留 一b g e 采用形态 生理生化特征鉴定与1 6 sr d n a 分析两种方法同时对b z s 2 1 菌 株进行种属鉴定 并互相对照和印证 可以确定b z s 2 1 菌株为类产碱假单胞菌 p s e u d o m o n a s p s e u d o a l c a l i g e n e s 4 培养基的组成对类产碱假单胞菌b z s 2 1 环氧化物水解酶对映体选择性影 响明显 以i 蔗糖为碳源 0 2 牛肉膏和o 2 蛋白胨及1 5 尿素为复合氮源 时 该菌株产生的环氧化物水解酶对映体选择性最好 不过该菌株的生长与对映 体选择性并没有直接联系 使用全细胞在水相体系中拆分反式 3 e p g 时 缓冲体系和p h 值 细胞浓度 助溶剂等对拆分影响很大 当使用细胞浓度为1 5 1 发酵液体积 细胞悬浮液体 积 p h8 0 的1 0 0m m o l l 磷酸缓冲液 1 0 d m f 为助溶剂 可将1 0m m o l l 反 式 3 一e p g 有效拆分 保留 2 r 3 s 3 e p g 的e e 值为9 5 产率为2 6 研究表明 虽然类产碱假单胞菌b z s 2 1 同时具有环氧化物水解酶和酯酶活 力 但其酯酶活力与e p g 的对映体选择性水解无关 5 利用类产碱假单胞菌b z s 2 1 环氧化物水解酶粗酶 对不同反应体系中 e p g 拆分的研究表明 该酶可以在水一有机溶剂组成的两相体系中将e p g 有效拆分 当两相体系中 含有疏水性最强的异辛烷2 0 2 5 时 酶的对映体选择性最高 通过选择不同的表面活性剂可以改变该酶的对映体选择性 离子型表面活性 剂不利于反应的对映体选择性 且对酶反应有明显的抑制作用 非离子型表面活 性荆可以改善反应的对映体选择性 其中以吐温6 0 效果最好 而且 反应体系 中添加2 吐温6 0 可以使较高浓度 7 8r n m o l l 的e p g 获得有效的拆分 保留e p g 的e e 值为9 8 产率为3 3 这对手性环氧化物的制备是很有意义的 环糊精通过与e p g 形成超分子结构的包含化合物而使其增溶或乳化 在3 0 m m o l l 羟丙基 b 环糊精诱导的乳化体系中 类产碱假单胞菌b z s 2 1 环氧化物水 解酶的对映体选择性显著提高 山东大学博士学位论文 6 对黑曲霉h n g 5 环氧化物水解酶粗酶的性质和苄基缩水甘油醚的拆分进 行了研究 结果表明 3 0m g m l 的粗酶在3h 内可将2 0 0i n m o l l 的外消旋b g e 拆分得到1 0 0 e e 的 月 一b g e 产率为2 2 因此 该酶可望用于高浓度b g e 的拆分 关键词 环氧化物水解酶 3 苯基缩水甘油酸乙酯 类产碱假单胞菌 拆分 对映体选择性 山东大学博士学位论文 a b s t r a c t 1 o p t i c a l l yp u r e e p o x i d e sa r ev e r s a t i l ec h i r a lc o m p o u n d si no r g a n i cs y n t h e s i s v a r i o u sc h e m i c a la n d b i o l o g i c a lm e t h o d sf o rs y n t h e s i so fc h i r a le p o x i d e sh a v eb e e n d e v e l o p e d r e s o l u t i o no fr a c e m i ce p o x i d e sb ye p o x i d eh y d r o l a s e si sap r o m i s i n gw a y o fa c h i e v i n gt h i s e p o x i d eh y d r o l a s e sr e q u i r en oc o f a c t o ra n d d e p e n d i n go nt h e s u b s t r a t e m a ys h o wh i g he n a n t i o s e l e e t i v i t ya sw e l la sh i g ha c t i v i t y a sac o n s e q u e n c e t h e yc a l lb eu s e dt op r e p a r ee n a n t i o p u r ee p o x i d e sa n d o rv i c i n a ld i o l sf r o mc h e a p r a c e m i ce p o x i d e s 2 u s i n gd o u b l e w a v e l e n g t hs p e c t r o p h o t o m e t r yi nm i c r o t i t e rp l a t e t h ec o r r e l a t i o n b e t w e e nt h ea b s o r p t i o na n de p o x i d ec o n c e n t r a t i o nw a ss t u d i e di np h o s p h a t eb u f f e r a n db a c t e r i a lc e l ls u s p e n s i o n i tw a sf o u n d b yc o m p a r i s o n t h a tt h et w or e g r e s s i v e c u r v e si nt h et w os y s t e m sp a r a l l e lw i t he a c ho t h e r a n di tw a si n f e r r e da n d p r o v e dt h a t e p o x i d ec o n c e n t r a t i o ni nc e l ls u s p e n s i o n sc o u l db ec a l c u l a t e du s i n gt h er e g r e s s i v e c u r v ei nt h eb u f f e rs y s t e ma ss t a n d a r dc u r v e b a s e do nt h ed o u b l e w a v e l e n g t h s p e c t r o p h o t o m e t r i cm e t h o dt od e t e r m i n a t ee p o x i d e e p o x i d eh y d r o l a s ea c t i v i t yc o u l d b ea s s a y e dq u i c k l ya n dc o n v e n i e n t l y h i g hp e r f o r m a n c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sr h p c e i su s e dw i d e l yi ne n a n t i o m e r a n a l y s i s u s i n g5 s u l f a t e d b c y c l o d e x t r i na sc h i r a ls e l e c t o r a n d2 5n u n o l l 曲o s p h a t es o l u t i o n p h 2 5 a sr u n n i n gb u f f e r t h e b a s e l i n e s e p a r a t i o n o f p h e n y l e t h a n o d i o le n a n t i o m c r sw a sa c h i e v e db yc a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i su n d e r s e p a r a t i o nv o l t a g eo f 一2 5k v a t2 5 c w i t ht h ec o m b i n a t i o no f e p o x i d ea s s a yb yd o u b l e w a v e l e n g t hs p e e t r o p h o t o m e t r yi n m i e r o t i t e rp l a t ea n dc h i r a lr e s o l u t i o no fp h e n y l e t h a n o d i o lb yh p c e af a s ta n d e f f e c t i v es y s t e mw a se s t a b l i s h e df o r s c r e e n i n go fm i c r o b i a ls t r a i n s w i t hh i g h e n a n t i o s e l e c t i v ee p o x i d eh y d r o l a s ea c t i v i t y 4 山东大学博士学位论文 3 i th a sb e e nv e r yi m p o r t a n tt od i s c o v e rn o v e le p o x i d eh y d r o l a s e s e n a n t i o p u r e g l y c i d a t e sf i r ee x t r e m e l yi m p o r t a n tc o m p o u n d s i nc h i r a ld r u g ss y n t h e s i s i np a r t i c u l a r s o m eg l y c i d a t e sa r ek e yi n t e r m e d i a t e sf o rt a x o la n dt a x o t e r es i d ec h a i n s d i l t i a z e m a n db e s t a t i n e ta 1 t h e r e f o r e m i c r o b i a ls t r a i n sw e r es c r e e n e dc a p a b l eo fp r o d u c i n g e p o x i d eh y d r o l a s ew i t hm g he n a n t i o s e l e e t i v i t yt o w a r d sg l y c i d a t e s c o n s i d e r i n gt h a tg l y c i d a t e sh a v eb o t ho x i r a n er i n ga n de s t e rb o n d s t y r e n e o r s t y r e n eo x i d ew a su s e d a sm o d e ls u b s t r a t ef o re p o x i d eh y d r o l a s e p r o d u c i n gs t r a i n s s c r e e n i n g f o rt h ef i r s tt i m e ab a c t e r i a ls t r a i nb z s 2 1w a ss c r e e n e d w i t hh i g h e n a n t o s e l e c t i v i t yt ot r a n se t h y l3 p h e n y lg l y c i d a t e e p g t h es t r a i nc o u l dh y d r o l y z e r a c e m i ce p gw i t ht0 0 e eo f 躲 3 s 3 一e p gr e m a i n e d a n dc o m p a r e dw i mm o s t k n o w ne p o x i d eh y d r o l a s e s t h es t r a i ns h o w e dc o m p l e m e n t a r ye n a n t i o s e l e c t i v i t yf o r s t y r e n eo x i d eh y d r o l y s i s i na d d i t i o n as t r a l na s p e r g i l u sn i g e rh n g 5w a sa l s o s c r e e n e d w h i c hc o u l dh y d r o l y z e dr a c e m i eb e n z y lg l y c i d y le t h e r b g e w i t h 矗 b g e r e m a i n e d t h es t r a i nb z s 2 1w a si d e n t i f i e d 丛p s e u d o m o n a s p s e u d o a l c a l i g e n e sa c c o r d i n gt o i t sm o r p h o l o g i c a la n dp h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s a n da l s o1 6 sr r n a a n a l y s i s 4 t h ee n a n t i o s e l e c t i v i t yo f p p s e u d o a l c a l i g e n e sb z s 2 1w a s s t r o n g l yi n f l u e n c e db y t h em e d i ac o m p o s i t i o n w i t h1 s u c r o s ea sc a r b o ns o u e c e 0 2 b e e f e x t r a c t 0 2 p e p t o n ea n d1 5 u r e aa sm i x e dn i 廿o g e ns o u r c e t h es t r a i np r o d u c e de p o x i d e h y d r o l a s ew i t ht h e h j g h e s te n a n t i o s e l e c t i v i t y h o w e v e r t h eg r o w t ha n d e n a n t i o s e l c e t i v i t yo f t h es t r a i nd i dn o tc o r r e l a t ew i t he a c ho t h e r t h ec e l l ss u s p e n d e di n1 0 0m m o l lp h o s p h a t eb u f f e r p h8 0 1 c o n t a i n i n g1 0 d m f v v a sc o s o l v e n tp r o d u c e d 2 r 3 s e p gw i t h9 5 e ea n d2 6 y i e l di n12 h f r o m0 2 w v o f t h er a c e m i cm i x t u r e t h o u g hp p s e u d o a l c a l i g e n e sb z s 2 1s h o w e de s t e r a s ea c t i v i t yt o1 3 n a p h t h y la c e t a t e t l ee s t e r a s ew a s p r o v e dn o tt ob er e s p o n s i b l ef o re n a n t i o s e l e c t i v eh y d r o l y s i so f e p g 5 t h ea p p l i c a t i o n si nv a r i o u sr e a c t i o ns y s t e m sw e r es t u d i e du s i n ga ne p o x i d e h y d r o l a s e p r e p a r a t i o n f r o m p p s e u d o a l c a l i g e n e s b z s 2 1 6 1 e p gw a sr e s o l v e di ns o m eb i p h a s i cs y s t e m s w h e n2 0 2 5 o f i s o o c t a n ew a s c o n t a i n e di nt h es y s t e m t h ee n z y m es h o w e d h i 曲e n a n t i o s e l e c t i v i t y 2 t h ee n a n t i o s e l e c t i v i t yo ft h ee n z y m ec o u l db ea l t e r e db yv a r i o u ss u r f k t a m s i o ns u r f a c t a n t sw e r en o tg o o dt oe n a n t i o s e l e c t i v i t yo ra c t i v i t yo ft h ee n z y m e 0 nt h e o t h e rh a n d n o n i o ns u r f a c t a n t s i n c l u d i n gt w e e n6 0a n dt w e e n8 0 c o u l di m p r o v e t h e e n a n t i o s e l e c t i v i t y i np a r t i c u l a r w h e n2 o ft w e e n6 0w a su s e di nt h ee m u l s i o n s y s t e m u pt o7 8m m o l lo f e p gw a sh y d r o l y z e dw i t ht h er e m a i n i n gs u b s t r a t eo f9 8 e ea n d3 3 y i e l d w h i c hw a so fs i g n i f i c a n t p o t e n t i a l sf o rc h i r a le p o x i d ep r e p a r a t i o n 3 f o rc y c l o d e x t r i n i n d u c e de m u l s i o ns y s t e m s 3 0m m o l lo fh y d r o x y p r o p y l b c y c l o d e x t r i nc o u l di m p r o v et h ee n a n t o s e l e c t i v i t ys i g n i f i c a n t l y 6 u s i n g a l le p o x i d eh y d r o l a s ep r e p a r a t i o nf r o ma s p e r g i l l u sn i g e rh n g 5 2 0 0 m m o l lo f r a c e m i cb g ew a sr e s o l v e di n3hw i t hr e m a i n i n g b g eo f1 0 0 e ea n d 2 2 y i e l d t h a ts u g g e s t e dt h a te p o x i d eh y d r o l a s eo f a s p e r g i l l u s 喀p rh n g 5c o u l d b eu s e di nt h er e s o l u t i o no f h i g hc o n c e n t r a t i o no f b g e k e yw o r d s e p o x i d e h y d r o l a s e e n a n t i o s e l e c t i v i t y e t h y l3 p h e n y lg l y c i d a t e p s e u d o m o n a s p s e u d o a l c a l i g e n e s r e s o l u t i o n 山东大学博士学位论文 a c e a o t b g e c d c t a b d f d m s o e e e h e p g h h p c e m 匝h 符号缩写说明 a n g i o t e n s l o n c o n v e m n ge n z y m e d i o c t y ls o d i u ms u l f o s u c c i n a t e b e n z y lg l y c i d y le t h e r c y c l o d e x t r i n h h e x a d e c y l t r i m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e n n d i m e t h y lf o r m a d i e d i m e t h y ls u l f o x i d e e n a n t i o m e r i ce x c e s s e p o x i d eh y d r o l a s e e t h y l3 p h e n y l g l y c i d a t e h u m a ni m m u n o d e f i c i e n c yv i r u s h i 曲p e r f o r m a n c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s m a m m a l i a nl i v e rm i c r o s a m a le p o x i d eh y d r o l a s e 哺乳动物肝微粒体环氧化物水解酶 n n b i s s a l i c y l a l d e h y d o e t h y l e n e d i a m i n e 血管紧张素转化酶 琥珀酸二辛酯磺酸钠 苄基缩水甘油醚 环糊精 十六烷基澳化三甲铵 n n 一二甲基甲酰胺 对映体过量 环氧化物水解酶 3 苯基缩水甘油酸乙酯 人免疫缺陷病毒 高效毛细管电泳 山东大学博士学位论文 第一章前言 1 1 手性环氧化物的重要性 手性 c h i r a l i t y 是生命体的基本属性 如自然界普遍存在的氨基酸为l 型 脱 氧核糖为d 型 而蛋白质和d n a 的螺旋结构又都是右旋的 不同的手性在生命 过程中发挥着独特的功能 因此也产生了药物的手性问题 许多情况下 手性化 合物的一对对映体在生物体内的药理活性 代谢过程 代谢速率及毒性等方面存 在显著的差异 因此 许多国家对手性药物的开发 专利申请与注册 做出了相 应的规定 对于含有手性因素的药物 倾向于发展单一对映体产品 鼓励把已在 销售的外消旋药物转化为手性药物 对于申请新的外消旋药物 则要求对两个对 映体都必须提供详细的生理活性与毒理数据 而不得作为相同物质对待 由于这 些原因 导致了全球单一对映体药物的持续增长 如1 9 9 8 年销售额已达到9 6 4 亿美元 2 0 0 0 年约1 2 3 0 亿美元 预计2 0 1 0 年将达到2 0 0 0 亿美元 可以相信 以手性药物为代表的手性化合物的发展前景十分广阔 黄量和戴立信等 2 0 0 2 手性环氧化物是有机合成中非常重要的手性合成砌块和手性中间体 它含有 至少一个手性碳原子 通过选择性开环和官能团转换 可以方便地合成许多有生 物活性的手性化合物 因而在医药 农药 铁电液晶 香料 精细化学品工业上 有着极其重要的应用价值 图1 1 表1 1 手性缩水甘油酸醣类 o l y c i d a t e s 化合物是药物合成中非常有用的中间体 如 2 r 3 s 3 4 甲氧基苯基 缩水甘油酸甲酯是合成钙拮抗剂d i l t i a z e m 的 关键中间体 o e n e te ta l l 9 9 5 s e k ie t 以2 0 0 1 2 r 3 s 一3 苯基缩水甘油酸酯可 用于抗癌药物紫杉醇侧链的合成 g e n e te ta l l 9 9 5 y a m a g u c h ie la i 1 9 9 9 2 s 3 r 3 苯基缩水甘油酸酯则可用于具有促智作用的左旋黄皮酰胺的合成 杜 灿屏等 2 0 0 2 2 s 3 r 一3 苄基缩水甘油酸酯可用于抗癌药物氨肽酶n 抑制 剂b e s t a t i n p h e b e t i n p r o b e s t i n m r 3 8 7 等一系列化合物的合成 p u l i d o c e j u d oe t 以1 9 9 7 h u ae l a l1 9 9 8 等 参见图1 2 手性苄基缩水甘油醚 b e n z y lg l y c i d y le t h e r b g e 也是一类在天然产物和生 物活性物质不对称合成中有着广泛应用的中间体 如 s p i k e t p 是海洋天然药 山东大学博士学位论文 物s p o n g i s t a t i n1 的新型药效团 可促进微管解聚和阻止微管聚合 因而具有抗肿 瘤的作用 r 一b g e 是合成s p i k e t p 的起始原料 c u r t i ne t a l 2 0 0 1 m m p 2 抑制剂a b t 7 7 0 是一种新型抗癌药物 s b g e 则是其合成的原料 u c k u n e ta 1 2 0 0 0 r b g e 是合成a c e t o g e n i n s 等一大类免疫抑制剂的重要原料 l ie ta 1 1 9 9 8 b g e 还可用于手性氨基醇类化合物及一些b 受体阻断剂的合成 o t e se t a 1 1 9 9 8 此外 手性环氧化物也是一些重要的生物活性物质的关键结构单元 f i r m e y 1 9 9 8 图1 3 o p r 冀 r q h甲h r 基 c n r 冬 o h 图卜1 手性1 2 环氧化物的应用 f i g 1 1a p p l i c a t i o n so f c h i r a l1 2 e p o x i d e s 山东大学博士学位论文 表1 1 手性环氧化物作为中间体的应用实例 t a b l e1 1a p p l i c a t i o n so f c h i r a le p o x i d a sa si n t e r m e d i a t e s v 导 忿 孰 r r f o m l o t e m i 浮删 p m b c s l i n 叭少 nn n t n 7 c o o h b e s t 越m 紫杉醇 图1 2 手性缩水甘油酸酯作为中间体合成的手性药物 f i g i 2c h i r a lp h a r m a c e u t i c ss y n t h e s i z e df r o mc h i r a g l y c i d a t e s o即 0 i k n 山东大学博士学位论文 龟坠眦io e n m p 弋州 图i 3 手性环氧化物作为结构成分的生物活性物质 f i g 1 3b i o l o g i c a la c t i v es u b s t a n c e sw i t hc h i r a le p o x i d e sa se l e m e n t so f s t r u c t u r e s 1 2 手性环氧化物的化学合成方法 手性环氧化物的合成方法可分为化学合成和生物催化合成 手性化合物的化学合成方法包括 1 不对称合成法 即在反应体系中引入 不对称因素 如手性试剂 催化剂等 该方法需在底物分子上引入手性辅助基团 控制反应立体选择性 需要大量手性物质 操作也较繁琐 2 手性源合成 该 方法是以廉价易得的天然手性物为原料 经构型保留 构型转化或手性转化等反 应 合成新的手性化合物 3 选择吸附拆分法 就是利用某种旋光性物质作为 吸附剂 使之选择性地吸附外消旋体中的一个 从而达到拆分的目的 结晶 法拆分 该方法是在外消旋体所形成的过饱和溶液中 加入某一对映体晶种进行 诱晶 得到该对映体 5 化学拆分法 其原理是将消旋体转化为非对映体 基 于非对映体的物理性质不相同 而将它们分开 6 动力学拆分 即在手性试剂 或催化剂作用下 利用两个对映体反应速度不同而使其分离 7 色谱分离 手性环氧化物的化学合成方法中较多采用的是 不对称合成即前手性烯烃的 不对称环氧化和化学动力学拆分 1 2 1 前手性烯烃的不对称环氧化 1 9 8 0 年k a t s u k i s h a r p l e s s 1 9 8 0 提出了钛 酒石酸体系催化烯丙醇不对称 环氧化反应 这是手性环氧化物合成的一个重大的突破 图1 4 山东大学博士学位论文 图l 4 钛 酒石酸体系催化烯丙醇不对称环氧化 f i g 1 4a s y m m e t r i ce p o x i d a t i o nc a t a l y z e db yt i t a r t a r a t es y s t e m 1 0 年之后 j a c o b s e n z h a n ge t a l 1 9 9 0 和k a t s u l d i r i ee l a l 1 9 9 0 分别研 究了手性 s a l e n m n i i i 体系对共轭烯烃的不对称环氧化 图l 一5 i oi r 嘞帮r 审 图1 5 手性 s a l e n m n 1 1 1 体系对非官能团顺式烯烃的不对称环氧化 f i g 1 5c h i r a l s a l e n m n 1 l i c o m p l e x c a t a l y z e d a s y m m e t r i ce p o x i d a t i o no f n o n f u n c t i o n i z e dc sa l k e n e 所用的催化荆结构式如图1 6 所示 图1 6s a l e nm n o i l 催化剂 f i g 卜6s a l e nm i i i c o m p l e x 1 2 2 外消旋环氧化物的化学动力学拆分 1 9 9 7 年j a c o b s e n 等 t o k u n g a n ae ta 1 1 9 9 7 报道了手性 s a l e n c o i i i 作 为催化剂水解动力学拆分末端环氧化物获得成功 s a l e n 来源于n n b i s s a l i c y l a l d e h y d o e t h y l e n e d i a m i n e 是近年来不对称合成中最重要和最活跃的配 体之一 该反应以水为唯一试剂对消旋体的末端环氧化物进行拆分 可得到高立 山乐大学博士学位论文 体选择性和高产率的手性环氧化物和1 2 二醇化合物 图1 7 它不仅提供了一 种通用和实用的制各高纯度的末端环氧化物的方法 而且也提供了一种高选择性 合成手性1 2 二醇的有效途径 该方法操作简单 后处理方便 几乎定量的产率 高的立体选择性 广泛的适应性 有其独特的优势 虽催化剂可以循环使用 但 其成本仍较高 使其大规模生产受到限制 该水解拆分所用催化剂如图i 8 所示 尸0 h2 面 s s l o 2而m01 丽 赢0 0 yi c 砌dh0 55m01 r t 1 2 h v i e l d h 2 乞o e n v e l d 9 8 e e 9 8 e e 图1 7 手性s a l e nc o 1 i d 催化的环氧化物不对称水解 f i g i 7c h i r a ls a l e nc o i i i c a t a l y z e da s y m m e t r i ch y d r o l y s i so f e p o x i d e s 图1 8 手性s a l e n c o 1 1 1 催化剂 f i g 1 8c h i r a ls a l e n c o 1 1 1 c o m p l e x 1 3 手性环氧化物的生物合成方法 手性化合物的生物合成是利用微生物或酶的高度的立体 化学和区域选择性 将化学合成的外消旋化合物 前体或潜手性化合物转变成单一光学活性产物 手 性环氧化物及其水解产物邻二醇的生物合成 主要有两种途径 一种是利用酶或 作为酶源的微生物完整细胞为手性合成催化剂 实现前手性烯烃的不对称环氧 化 其中主要是利用单加氧酶和氯过氧化物酶催化合成 另一种是以酶为手性拆 分催化剂 对外消旋环氧化物进行动力学拆分转化 主要是利用脂肪酶 酯酶和 环氧化物水解酶进行拆分转化 1 3 1 单加氧酶催化体系 某些微生物含有单加氧酶 m o n o o x y 薛n a s e 体系 单加氧酶在辅酶n a d p h 山东大学博士学位论文 存在下 活化分子氧 并将氧有效地插入烯烃分子中 从而实现烯烃的环氧化反 应 v a nt i e rl i n d e r 1 9 6 3 描述了铜绿假单胞菌 p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a 催化 辛烯环氧化的过程 随后筛选了大量具有环氧化物酶活性的菌株 并对其催化性 质进行了研究 结果表明能够催化烯烃环氧化的微生物有烷烃利用菌和烯烃利用 菌 但并非所有的具有环氧化物酶活性的微生物细胞都具有立体选择性 w e i j e r s 等 1 9 8 8 1 拘研究结果表明 以甲烷为生长底物的甲烷氧化细菌以及以其它烷烃生 长的微生物 尽管也催化烯烃环氧化 但没有立体选择性 在所有含烷烃单加氧 酶 a l k a n em o n o o x y g e n a s e 的烷烃利用菌和含烯烃单加氧酶 a l k e n e m o n o o x y g e n a s e 的烯烃利用菌中 能够催化烯烃立体选择性环氧化的细菌仅限 于以长链烷烃生长的假单胞菌 p s e u d o m o n a ss p 和以烯烃生长的分枝杆菌 m y c o b a c t e r i u ms p 诺卡氏菌 n o e a r d i as p 黄杆菌 x a n t h o b a c t e rs p 等 菌株 w e i j e r s 小组 h a b e t s c r u t z e ne ta 1 1 9 8 5 进一步的研究发现 对同一菌株 环氧化产物的对映体组成与培养条件和底物有关 对同一底物 不同菌株的立体 选择性不同 上述反应中最有价值的是s h e l l 和g i s t b r o c a d e s 公司 j o h n s t o n ee t 口 1 9 8 7 p h i l i p se ta 1 1 9 8 8 用完整细胞催化芳基烯丙基醚立体选择性环氧化合成 s 芳基缩水甘油醚 并以此为中间体成功地合成了 s p 一肾上腺素能受体阻断剂 美托洛尔和阿替洛尔 1 3 2 氯过氧化物酶催化体系 从微生物细胞中分离的单加氧酶用于烯烃环氧化反应 由于分离费用高 纯 酶不稳定 而且辅酶n a d p h 再生困难 显然不够经济 从c a l d a r i o m y c e s f u m a g o 中分离得到的氯过氧化物酶 c p o h a g e re la l 1 9 6 6 无需辅酶参与 以h 2 0 2 为氧化剂 能够有效地催化苯乙烯 丙烯 丁烯 丁二烯 环戊烯环氧化 g e i g e r t e t 口f 1 9 8 6 a l l m n 等 1 9 9 3 发现c p o 催化顺式烯烃环氧化 得到较高纯度的手 性环氧化物 1 3 3 环氧化物降解酶体系 另一方面 以酶为手性拆分催化剂 可对外消旋环氧化物进行动力学拆分 主要有环氧化物降解酶体系 有些微生物可以将环氧化物的 种对映体直接降 山东大学博士学位论文 解 从而可得到单一构型的环氧化物 按此类途径进行动力学拆分的大部分是烯 烃利用菌 例 乙烯利用菌分枝杆菌e 2 0 和分枝杆菌e 4 4 可以选择性地将环氧 乙烷降解 w e i j e r s 等 1 9 8 8 研究发现x a n t h o b a c t e r p y 2 可使2 3 环氧丁烷的 2 s 对映体降解 而得到光学纯的 2 r 3 r 一环氧丁烷 1 3 4 脂肪酶 百旨酶水解体系 脂肪酶 1 i p a s e s 或酯酶 e s t e r a s e 是一类特殊的酯键水解酶 在环氧化物的环 氧单元构成对映体识别的基础上 当分子中含有可拆分的基团 o h 一c o o h c o o r 时 可利用脂肪酶 酯酶水解拆分 获得光学活性的环氧化物 在需要 合成手性环氧化合物的两个对映体时 该方法相当有用 脂肪酶 酯酶属于界面 催化剃 因而不要求底物一定具有水溶性 不需辅因子 在水溶液中催化酯的水 解反应和在非水介质中催化酯化反应和酯交换反应有很高的立体选择性和拆分 效率 用于制备手性中间体的研究报道较多 如 r 丁酸缩水甘油酯可用于合成 s p 阻断荆 利用脂肪酶大规模水解已达吨级水平 l a n d e r w h i t e s i d e s 1 9 8 4 但该酶对所拆分的环氧化物底物的分子结构有特殊要求 使其在用于手性环氧化 物拆分方面受到了限制 另外 缩水甘油酸酯类化合物亦可用脂肪酶或酯酶拆分 如 目前 2 r 3 s 3 4 一甲氧基苯基 缩水甘油酸甲酯的生产主要是通过脂肪 酶催化外消旋体的拆分而来 不过 在脂肪酶拆分过程中 水解产生的缩水甘油 酸不稳定 迅速脱羧生成相应的醛 这种醛会使脂肪酶发生不可逆的变性失活 从两为其应用带来困难 g e n t i l e g i o r d a n o1 9 9 2 b r a u n k 1 e i n1 9 9 6 l 1 4 环氧化物水解酶 1 4 1 环氧化物永解酶概述 环氧化物水解酶 e p o x i d eh y d r o l a s e e c 3 3 2 3 又称环氧化物水合酶 e p o x i d e h y d r a t a s e 或环氧化物水化酶 e p o x i d eh y d r a s e 是一种普遍存在于生物体内的 酶 能立体选择性地将水分子加到环氧底物上生成相应的1 2 二醇 环氧化物具有张力三元环和极性碳氧键 是相当活泼的