（生物化学与分子生物学专业论文）哺乳动物粪便dna提取技术研究.pdf

摘要 哺乳动物粪便d n a 提取技术研究 硕士研究生赵健元导师李进华教授 ( 安徽大学生命科学学院，安徽省生态工程与生物技术重点实验室， 合肥，2 3 0 0 3 9 ) 摘要 以粪便为材料提取动物d n a 进行保护遗传学和分子生态学研究的关键是能 否提取到高质量的粪便d n a 。自粪便d n a 分析技术兴起后，国内外在这方面做 出了巨大的成就，发展了多种粪便d n a 提取方法，充分证实了粪便d n a 分析 的可行性。但仍存在以下问题：各种提取方法通用性不好。在许多实验中存在 扩增成功率在物种和个体之间的差异。这一直是阻碍粪便d n a 提取技术推广的 主要障碍。虽然专用粪便d n a 提取试剂盒有着较好的通用性，但昂贵的价格限 制了该试剂盒的广泛应用，因此构建一套效果好、通用性好、性价比高的粪便 d n a 提取方法，可以大大推进粪便d n a 技术的推广。对陈旧粪便d n a 提取 的研究还是空白。本文所指的陈旧粪便是保存超过2 年以上的粪便样品。从陈旧 粪便中提取d n a 对于充分利用迁出或死亡动物的遗传信息，扩大分子粪便学技 术的应用范围具有十分重要的作用。对粪便最佳保存方法的摸索。保存方法合 适与否对粪便d n a 质量影响很大，有许多学者对各种保存方法的保存效果进行 了比较研究，但结果并不一致甚至相互抵触，这种矛盾影响了研究者对保存方法 的选择。间接地阻碍了粪便d n a 技术的发展。未考虑到与d n a 提取相关环 节对结果的影响。由于粪便材料的特殊性，它的提取结果受到多重因素的影响， 如样品的采集、保存等等，忽视其中任何一个环节，都会给试验结果带来不利影 响甚至导致试验失败。 本文以l1 种哺乳动物粪便为材料，分别构建了2 种新的提取方法解决了问 题和；以粪便d n a 提取产物的浓度和纯度为指标，用正交分析对问题和 哺乳动物粪便d n a 提取技术研究 进行了分析，主要结果如下： 1 、本论文中构建的改进型c t a b 提取方法广泛适用于各食性哺乳动物粪便 d n a 提取，成功率高，一般不需重复提取。我们总计对1 1 种动物粪便进行了 d n a 提取验证，仅一次提取即得到高质量的模板d n a ，对p c r 产物的测序结 果也证实了方法的可靠性和通用性。虽然德国q i a g e n 公司的粪便d n a 提取专 用试剂盒q i a a m pd n a s t o o lk i t 也有着较好的通用性，但其昂贵的价格( 5 0 元 次) 使其在大量分析样品时受到很大的限制。与之相比，本方法成本低廉，每提 取一个样品的成本低于3 元，用实验室常用试剂即可完成粪便d n a 提取，同时 产物纯度高于专用试剂盒。即拥有超过专业试剂盒提取效果，又尽可能的降低了 实验成本，真正实现了实验室通用性，有利于粪便d n a 技术的迅速推广。 2 、在对陈旧粪便d n a 提取研究中，通过多管收集一预处理一有机溶剂抽 提的方法，从无水乙醇常温保存3 4 5 年的陈旧粪便中提取到d n a 并成功的进 行了p c r 扩增和测序，实验效果大大优于其他方法。它证明了陈旧粪便d n a 提 取及应用的可行性，解决了因动物的迁出或死亡而无法再获得这些动物的分子遗 传信息的困难，拓宽了粪便d n a 分析技术的应用范围。 3 、通过正交实验对粪便d n a 的纯度和浓度分别进行分析，得出以下结论： 保存方法、样品与保存物质比例和保存温度三个因素对粪便d n a 提取产物的浓 度有显著影响，但对产物的纯度影响不大：保存时间并非影响粪便d n a 质量的 主要因素，因此若保存策略( 前三个因素) 正确，粪便样品应可以有效保存很长 时间。本实验得出的最佳保存策略为：用8 倍于粪便样品体积( 1 m g 粪便样品换 算为lr t l 保存液) 的d e t s 浸泡样品并置于一7 0 。c 保存。 4 、取样方法在粪便d n a 提取中非常重要，它对粪便d n a 产物浓度和纯度 均有显著影响。在取样方法合适的情况下，提取方法将决定产物的纯度，而暴露 时间和预处理影响产物浓度。最佳的提取流程为：尽量减少粪便在野外暴露时间、 d e t s 冷冻保存、采样外部取样、p b s 预处理、改进型c t a b 法提取粪便d n a ， 而粪便在野外暴露的时间则应越短越好。 关键词：粪便d n a ；通用性方法；陈旧粪便；粪便保存；p c r 扩增 i l a b s t r a c t r e s e a r c ho nd n a e x t r a c t i n gt e c h n o l o g y f r o mm a m m a l i a nf a e c e s m a s t e rc a n d i d a t ez h a oj i a n y u a n a c a d e m i ca d v i s o r ( s c h o o lo fl i f es c i e n c e ，a n h u iu n i v e r s i t y , a n h u ik e yl a b o r a t o r yo f e c o l o g i c a le n g i n e e r i n ga n db i o t e c h n o l o g y , h e f e i ，2 3 0 0 3 9 ，c h i n a ) a b s t r a c t e x t r a c t i n gd n a f r o mf a e c a ls a m p l ei sa n e w l yd e v e l o p e dt e c h n o l o g yr e c e n ty e a r s a s a l li d e a ln o n i n v a s i v es a m p l i n gw a y , i ta l l e v i a t e ss a m p l i n gp r o b l e m sw h i c he x i s t e d l o n g t e r m l yi nc o n s e r v a t i v eg e n e t i c sa n dm o l e c u l a re c o l o g ys t u d i e s t h ec o r eo ft h i s t e c h n o l o g yi sw h e t h e rt h eh i g hq u a l i t yf a e c a ld n ac a nb ee x t r a c t e df r o mf a e c a l s a m p l e s a l t h o u g hs e v e r a lm e t h o d st oe x t r a c td n a f r o mf a e c e sh a db e e nd e v e l o p e d h o m ea n da b r o a d ，i tc o n f i r m e dt h ep o s s i b i l i t yo ff a e c a ld n a a n a l y s i st e c h n o l o g yi na c e r t a i ne x t e n t s o m eq u e s t i o n sb e l o wh a d n tb e e ns o l v e dy e t t h ec u r r e n c yo fm o s t m e t h o d si sn o tg o o d i nd i f f e r e n te x p e r i m e n t st h er e s e a r c h e r sa l w a y sg o td i f f e r e n t a m p l i f ys u c c e s sr a t eb e t w e e nd i f f e r e n ta n i m a ls p e c i e sa n di n d i v i d u a l s t h i sq u e s t i o n h a m p e r e dt h ed e v e l o p m e n ta n ds p r e a do f m o l e c u l a rs c a t o l o g yb a d l y a tt h es a m et i m e t h ep r i c eo ft h ek i tf o re x t r a c t i n gf a e c a ld n ai se x p e n s i v e s oi tm a k es e n s et o d e v e l o pan e wm e t h o dw h i c hh a sg o o dc u r r e n c ya n dc h e a pc o s t t h en e wm e t h o dw i l l a c c e l e r a t et h es p r e a do fm o l e c u l a rs c a t o l o g y m o s tr e s e a r c h e sa d d r e s s e df r e s h s a m p l e s ( t h ef a e c e sp r e s e r v e df o rl e s st h a n2 4m o n t h s ) a n dh a dn o tr e s e a r c h e so n d n a e x t r a c t i n gf r o mo l df a e c e sy e t e x t r a c t i n gd n a f r o mo l df a e c e si si m p o r t a n tf o r m a k i n g f u l lu s eo fg e n e t i ci n f o r m a t i o no fd i e da n i m a l so r m i g r a t o r y a n i m a l s i i 哺乳动物粪便d n a 提取技术研究 e v a l u a t i n gt h er e l a t i v ee f f e c t i v e n e s so ff a e c a lp r e s e r v i n gm e t h o d sf o rf a e c a ld n a a n a l y s i s t h ep r e s e r v a t i o nm e t h o d sa f f e c tt h ef a e c a ld n aq u a l i t ya n dq u a n t i t y b e c a u s et h e yc a ni n a c t i v a t et h ee n d o g e n o u sn u c l e a s e sa n dp r o t e c td n af r o md e c a y i n g a l t h o u g hs o m er e s e a r c h e r se v a l u a t et h ee f f e c t i v e n e s so fp r e s e r v a t i o nm e t h o d sb y c o m p a r i n gd i f f e r e n ta m p l i f ys u c c e s sr a t e t h er e s u l t sa r ed i v e r s eb e t w e e nd i f f e r e n t r e s e a r c h e s s o m er e s u l t sa r ei l l o g i c a l i t yi n d e e d t h ec o n t r a d i c t i o no fp r e s e r v a t i o n m e t h o d si n f l u e n c e st h ec h o i c eo fr e s e a r c h e ra n dh a m p e r st h ed e v e l o p m e n to f m o l e c u l a rs c a t o l o g yi n d i r e c t l y h a dn o tp a ya t t e n t i o nt ot h ei n f l u e n c eo fm u l t i p l e v a r i a b l e so nt h eq u a l i t ya n dq u a n t i t yo fd n ae x t r a c t e df r o mf a e c a ls a m p l e s f o rt h e p a r t i c u l a r i t yo ff a e c a ls a m p l e ，t h eq u a l i t ya n dq u a n t i t yo fd n a e x t r a c t e df r o mf a e c a l s a m p l e sc o u l db ea f f e c t e db yf a c t o r s ，s u c ha ss a m p l i n ga n dp r e s e r v a t i o n a n yf a c t o r c a n tb ei g n o r e do t h e r w i s et h ee x p e r i m e n t sw i l ll o s to rc a n tg e tg o o dr e s u l t s 11k i n d s o fd i f f e r e n tm a m m a l s f a e c e sh a db e e nu s e di nt h i ss t u d y t w on e wd n a e x t r a c t i n g m e t h o d sh a v eb e e nd e v e l o p e df o rs o l v i n gt h eq u e s t i o n1a n d 2 o r t h o g o n a ld e s i g nh a d b e e nu s e dt o a n a l y z et h eq u a l i t y a n dq u a n t i t yo ff a e c a ld n ar e s p e c t i v e l yf o r i n v e s t i g a t i n gt h eq u e s t i o n3a n d4 t h em a i nr e s u l t so b t a i n e da r es h o w na sf o l l o w s i 1 t h ed n a e x t r a c t i n gm e t h o d “i m p r o v e dc t a bm e t h o d ”w h i c h i sd e v e l o p e di nt h i s s t u d yi sa p p l i c a b l et om a n yk i n d so fm a m m a l sn om a t t e rt h e yh a v et h es a m ed i e th a b i t o rn o t w i t ht h i sm e t h o d ，h i g ha m p l i f ys u c c e s sr a t eh a sb e e ng o t i nt h ev a l i d a t i o no f t h en e wm e t h o d se f f e c t ，h i g hq u a l i t ya n dq u a n t i t yd n ah a v e b e e ne x t r a c t e df r o m1 1 d i f f e r e n tk i n d so fm a m m a l sj u s to n et i m e t h er e s u l t so fs e q u e n c i n gc o n f i r mt h e r e l i a b i l i t ya n dc u r r e n c yo f t h en e w m e t h o da l t h o u g ht h ek i t “q i a a m pd n as t o o lk i t h a v eg o o dc u r r e n c yi nf a e c a ld n a e x t r a c t i n g ，b u tt h eh i g hp r i c e ( 5 0y u a no n c et i m e ) r e s t r i c tt h ef a r - r a n g i n g a p p l i c a t i o no ft h ek i t i nc o n t r a s tt ot h ek i t ，t h ec o s to f i m p r o v e dc t a bm e t h o di s3y u a n 1 1 1 eq u a l i t yo fd n a e x t r a c t e db yi m p r o v e dc t a b m e t h o di sm u c hb e t t e rt h a nt h ed n ao b t a i n e db yk i t t h e r e f o r e ，t h en e wm e t h o d a c t u a l i z e st h ec u r r e n c yo fe x t r a c t i n gm e t h o d i tw i l lf a c i l i t a t et h es p r e a do fm o l e c u l a r s c a t o l o g y v a b s t r a c t 2i nt h es t u d yo fe x t r a c t i n gd n af r o mo l df a e c e s ，m u l t i t u b e p r e p r o c e s s p h e n o l c h l o r o f o r me x t r a c t i o nm e t h o dh a sb e e nu s e di no l df a e c e s d n ae x t r a c t i n g t w o g r o u pf a e c e sw e r el a u n c hi n t od n ae x t r a c t i n g o n eg r o u ph a db e e np r e s e r v e db y a b s o l u t ee t h a n o lf o r3y e a r sa n dt h eo t h e rg r o u ph a db e e np r e s e r v e db ya b s o l u t e e t h a n o lf o rh a l fp a s t4y e a r s w i t ht h i sm e t h o d ，w ee x t r a c t e dd n af r o mo l df a e c e s s u c c e s s f u l l ya n dg o ts o m eg e n e t i ci n f o r m a t i o nf r o mm t d n a a n dt h i sr e s u l tc o n f i r m s t h ep o s s i b i l i t yo f p u t t i n go l df a e c a li n t om o l e c u l a rs c a t o l o g ys t u d y 3 b yt h eo r t h o g o n a ld e s i g n ，s o m er e s u l t sc a nb eg o ta sf o l l o w s f i r s t l y , p r e s e r v a t i o n m e t h o d ，t h er a t i ob e t w e e ns a m p l ea n dp r e s e r v a t i o nm a t e r i a l ，p r e s e r v a t i o nt e m p e r a t u r e h a v es i g n i f i c a n ti n f l u e n c eo nt h eq u a n t i t yo ff a e c a ld n a ，b u th a v eu n c l e a ri n f l u e n c e o nt h eq u a l i t yo ff a e c a ld n a s e c o n d l y , t l g eo p t i m a ls t r a t e g yo ff a e c a lp r e s e r v a t i o ni s u s i n gd e t st op r e s e r v ef a e c a ls a m p l e si n 一7 0 c ，t h er a t i ob e t w e e ns a m p l ea n d p r e s e r v a t i o nm a t e r i a li si ：8 f i n a l l y , p r e s e r v a t i o np e r i o di s n o tt h em a i nf a c t o r i n f l u e n c i n gt h eq u a l i t ya n dq u a n t i t yo fd n a s ot h ef a e c a ls a m p l e sc a nb ep r e s e r v e d f o rl o n gp e r i o da v a i l a b l yi f t h es a m p l e sb ep r e s e r v e db ya p r o p e rs t r a t e g y 4 s u b s a m p l em e t h o di sv e r yi m p o r t a n ti nf a e c a ld n ae x t r a c t i n g i th a ss i g n i f i c a n t i n f l u e n c eo nb o t ht h eq u a l i t ya n dq u a n t i t yo ff a e c a ld n a w h e nap r o p e rs u b s a m p l e m e t h o du s e d ，t h eq u a l i t yo ff a e c a ld n aw i l ll i eo nt h ee x t r a c t i n gm e t h o d ，t h eq u a n t i t y o ff a e c a ld n aw i l lr e s tw i t he x p o s e d p e r i o da n dp r e p r o c e s sm e t h o d n l eo p t i m a lf l o w o ff a e c a ld n a e x t r a c t i n gi ss a m p l i n gt h ef a e c a la f t e rp r o d u c e da ss o o na sp o s s i b l e - p r e s e r v i n gf a e c a ls a m p l e sw i t hd e t s ，s u b s a m p l i n gt h eo u t e rp a r to ff a e c a ls a m p l e ， p r e p r o c e s s i n gt h es a m p l e sw i t hp b s ，e x t r a c t i n gd n ab yi m p r o v e dc t a bm e t h o d k e yw o r d s ：f a e c a ld n a ；c u r r e n tm e t h o d ；o l df a e c a l ；f a e c a lp r e s e r v a t i o n ；p c r a m p l i f i c a t i o n v 独创性声明 y ：1 7 8 5 8 5 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 猢鲐莅! 冀必鳓飙秒舀午名月形日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解透獬关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阋。本人 授权睦霈钾妨以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文储鲐议参 签字日期：硼年，月( 。日 学位论文作者毕业去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签名 签字日期： 扫。g 电话 邮编 。 月，翼 符号说明 a f l p b s a c t a b d e l 瓷 d m s o d n t p e b e d l a e s u g u s c n m t d n a p b s p c r p r i m e r i 强l p r a p d r p m s d s s s c p t r i s t e ( b u f f e r ) 符号说明 扩增片段长度多态性 小牛血清白蛋白 十六烷基三甲基溴化铵 d m s 0 e d l t r i s 盐溶液 二甲亚砜 脱氧核苷三磷酸 溴化乙锭 乙二胺四乙酸二钠 进化显著单元 硫氰酸胍 线粒体d n a 磷酸盐缓冲液 聚合酶链反应 引物 限制性内切酶片段长度多态性 随机扩增多态d n a 每分钟转速 十二烷基硫酸钠 单链构象多态性 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 t “s e d t ab u f f e r 哺乳动物粪便d n a 提取技术研究 第一章前言 近年来，动物遗传信息在保护生物学及行为生态学中的应用受到普遍重视， 而进行遗传信息分析的首要工作就是采集分析样品。常用的采样方法主要有三 种：伤害性取样( d e s t r u c t i v es a m p l i n g ) ，即猎杀动物而获取新鲜的肌肉、肝脏 或血液等组织样品进行动物遗传物质的提取及分析，由于这种取样方法会对动物 资源造成极大破坏，因此许多研究者已经放弃了这种方法。非伤害性取样 ( n o n d e s t r u c t i v es a m p l i n g ) ，是通过捕获动物来抽取血液、采集毛发或羽毛、耳、 尾或趾等分析样品。也有一些非伤害性取样不需捕获动物，例如在对鲸或其他大 型哺乳动物的采样中，使用动物组织取样标枪( b i o p s yd a r tg u n ) 采集动物组织【l 】。 这类方法虽然不会导致动物死亡，但对野生动物特别是珍稀濒危动物的习性和生 存能力均会造成影响 2 】。非损伤性取样( n o n i n v a s i v es a m p l i n g ) ，指在不触及 或伤害野生动物本身的情况下，通过收集脱落的毛发或羽毛、粪便、尿液、食物 残渣( 含有口腔脱落细胞) 、鹿角、鱼鳞和卵壳等不同形式的分析样品进行遗传 物质的提取和分析】。 在动物遗传信息分析研究中，伤害性取样和非伤害性取样存在诸多问题，其 应用受到多方面的限制：首先，野生动物对人类是相当警觉的，大多出没于人类 难以到达的地区，因此猎捕动物进行伤害性月 伤害性取样具有一定的难度。其 次，在捕获或麻醉过程中，有可能会使动物受伤，严重时甚至导致死亡。此外， 捕获和麻醉可能会在不同程度上干扰动物的正常生理过程，刺激动物改变其行 为，如更换栖息地等。这些负面影响会严重地影响野外采集数据的准确性。如果 研究对象是濒危动物，对个体的伤害则有可能影响到整个种群，甚至整个物种的 安危。 随着分子生物学技术的发展、实验方法的改进和取样范围的扩展，采样方法 朝着简便可行、随机性强、对动物无伤害和无干扰的方向发展。特别是在对濒危 动物的研究中，由于伤害性取样和非伤害性取样均会给动物个体及种群带来相当 大的负面影响，因此非损伤性取样便成为了采样工作中的一项原则，在动物生态 学和保护遗传学研究领域中得到了极其广泛的应用。 第一章前言 l 非损伤性取样的种类 常用的非损伤性取样法主要有以下几种：毛发的非损伤性取样。毛发的毛 囊中含有足够的d n a ，可以通过杂交或p c r 探测m t d n a 和核基因组的某些位 点。随着分子生态学的兴起，该方法迅速在灵长类和熊类等珍稀濒危动物的研究 中得到应用。w o o d r u f f ( 1 9 9 3 ) 利用人和非人灵长类间具同源性的引物，通过毛 发研究了黑猩猩、大猩猩、长臂猿和猕猴的保护遗传学问题【l 。m o r i n 等( 1 9 9 4 ) 利用从巢区收集到的自由生活的黑猩猩毛发，通过微卫星检测分析了黑猩猩种群 间的血缘关系和种群结构；通过m t d n a 的细胞色素b 和d l o o p 的序列测定， 分析了黑猩猩种群间的基因流情况以及不同亚种问的亲缘关系等 1 1 , 1 2 1 。t a b e r l e t ( 1 9 9 4 ) 利用从野外收集到的欧洲棕熊毛发样品进行遗传信息分析，分析发现欧 洲东部和西部棕熊种群在遗传上有显著差异，确定他们属于不同的进化显著单位 1 3 o 关于毛发d n a 的提取方法主要是用蛋白酶消化法，后来发展的有蛋白酶消 化和c h e l e x1 0 0 结合的方法提取，由于c h e l e x1 0 0 是一种对多价金属离子具有 高度亲合力的鳌合树脂，可以通过鳌合许多金属离子来阻止d n a 的降解，从而 提取到较高分子量的d n a ，因此也得到了广泛的应用。口腔脱落细胞。i n o u e ( 1 9 9 3 ) 从新鲜食物残渣中提取到了口腔脱落细胞d n a ，并进行微卫星位点的 扩增，用于亲予鉴定【l ”。气味标记。丁波等( 1 9 9 8 ) 收集大熊猫留下的气味标 记并提取d n a ，进行细胞色素b 基因、d l o o p 环和t r n a 基因片段的p c r 扩增， 通过序列分析，证明了气味标记是一种新的简捷有效的d n a 来源【1 5 】。脱落的 羽毛。该方法主要应用于鸟类的保护遗传学研究 1 6 1 。粪便样品，在所有非损伤 性取样法中，利用粪便样品获取遗传信息被认为是最具潜在应用价值的【1 7 。下文 将对其进行详细介绍。 非损伤性取样法的主要优点是研究人员可以在不损伤动物的情况下获取所 需要的遗传信息，同时取样的成本不高，仅花少量的人力和物力就能得到所需的 样品。但与此同时非损伤性取样也存在一定的局限性，如从非损伤性样品中提取 的d n a 极其微量、降解严重、有些存在外源d n a 的污染，甚至含有大量的p c r 抑制物【1 。然而随着技术的不断完善，一些非损伤性取样法的局限性已经及时 被研究人员所克服，非损伤性取样法的适用范围和可靠性也在不断提高，该方法 将会受到越来越多研究人员的重视与青睐，具有广阔的应用前景。 哺乳动物粪便d n a 提取技术研究 2 粪便样品的优点 在非损伤性取样材料中，动物粪便是一种理想的分析样品，以其作为分析样 品提取动物d n a 并进行遗传信息分析具有很大的实际意义和应用价值：由于 动物排便具有节律性，因此相对于其他非损伤性取样材料来说，样品充足，易于 采集：粪便样本可以在不接触甚至不看到动物的情况下获得，对动物的干扰和 伤害小了，同时在研究大型食肉动物时也保护了野外工作者的人身安全；在对 种群较大物种进行大规模采样时，较捕获动物进行采样而言，采集粪便可以显著 降低采样的花费。因此，该方法破除了传统取样方法的种种不利因素，基本上解 决了保护遗传学和分子生态学研究中所遇到的取样难题。 3 粪便d n a 分析的理论依据及可靠性 动物体时时刻刻都在进行着新陈代谢，生成许多新细胞来替代老细胞，这些 被替代的细胞或是被分解，或是脱落，最终被重新吸收或排出体外。在粪便经过 肠道的过程中，肠道还会有一些脱落细胞混在其中，一同排出体外。研究表明， 每克人新鲜粪便中会含有1 0 5 个肠道细胞，而且大部分是活细胞【1 8 】，这就意味着 在动物粪便里也存在着大量的排便者细胞，因而从理论上讲就有可能从中分离出 动物的基因组d n a 。这为我们从粪便中获取排便动物的d n a 以进行遗传信息研 究创造了条件。 虽然粪便样品中的d n a 或多或少地存在一定程度的降解，但随着p c r 技术 的广泛应用，已经能够从质量不高的粪便d n a 模板中扩增出目的片段，这就使 粪便样品能够提供足够的遗传信息。由此可见，分子粪便学在方法上已渐趋成熟， 并进入实质性的应用阶段。利用该方法，研究者已对不同的哺乳类和鸟类进行了 种群生态学、行为生态学及保护遗传学等多方面的研究。h o s s 等于1 9 9 2 年发表 了第一篇关于从熊的粪便中获得d n a 的文章，标志着粪便d n a 分析技术的建 立，并开始为动物生态学和保护遗传学研究提供有价值的资料【19 1 。r e e d 等通过 抽提海豹粪便d n a 来分析海豹的种类、性别和个体身份，同时做了常规的食性、 寄生虫等研究，在1 9 9 7 年首次提出了分子粪便学( m o l e c u l a r s c a t o l o g y ) 的概念 1 2 0 , 即将传统的粪便分析方法与分子生物学技术相结合而产生的一种全新的取样 第一章前言 分析方法。 4 粪便d n a 分子标记 广义的分子标记( m o l e c u l a rm a r k e r ) 是指可遗传的并可检测的d n a 序列或 蛋白质。蛋白质标记包括贮藏蛋白和同工酶( 指由一个以上基因位点编码的酶的 不同分子形式) 及等位酶( 指由同一基因位点的不同等位基因编码的酶的不同分 子形式) 。狭义的分子标记概念只是指d n a 标记，而这个界定现在被广泛采纳。 本文也将分子标记概念限定在d n a 标记范畴。粪便d n a 中存在大量的分子标记。 首先粪便中也含有核d n a ，也就是说它具备核d n a 的所有标记，例j t l r f l p 、 r a p d 和a f l p 、s s c p 以及s s r s 等等；其次，粪便中含有大量的线粒体d n a ，而 线粒体d n a 主要来自受精卵的卵母细胞，因此粪便d n a 是研究母系遗传的良好 材料。下面分别进行介绍。 4 1 线粒体d n a 线粒体d n a 是共价闭合的双链d n a ，系母系遗传。它作为独立的核外遗传 物质和具有很高的拷贝数，很容易从不同组织中提纯。脊椎动物的m t d n a 基因 组比核基因组小而简单，且缺乏内含子，没有重复序列，无重组。这些特点使其 在分子系统进化的研究中变得特别有用，甚至有些学者认为几乎没有一种其它的 分子途径能与m t d n a 分析途径媲美 2 1 , 2 2 。细胞色素b 和控制区序列是m t d n a 的两 个最常用遗传标记，其中细胞色素b 序列进化速率适中，在种及种以上的系统进 化研究中应用的十分广泛；而控制区序列由于进化速度很快，特别适于种内亚种 水平及种群间的保护遗传学研究。在粪便基因组提取物中，线粒体d n a 的拷贝 数远远高于核d n a ，因而更容易被扩增出来 2 3 , 2 4 。 4 2 微卫星 微卫星( 又名简单重复序列) 是由简单重复的d n a 序列组成，每单元长度 在1 1 0 b p 之间，广泛分布于真核生物基因组中，因重复单元数目不同而呈现高 度多态性。通过对粪便中核基因组不同微卫星位点的扩增，可以得到多位点基因 型的基因图谱，并广泛用于野生动物的父权鉴定、亲缘关系、遗传多样性、种群 哺乳动物粪便d n a 提取技术研究 遗传结构及基因流程度等方面的研究【2 5 , 2 6 】。 4 - 3 多位点小卫星 动物基因组中存在着高变区( h y p e r v a r i a b l e ，h v r ) ，是具有高度遗传多态 性的区域，每一个h v r 均由包含串联重复的短序列构成，具有极强的个体特异性， 且按孟德尔方式遗传，是进行个体、群体及近缘种类研究的极好的遗传标记。 4 4 性别标记序列 在y 染色体上，有4 个不同的遗传标记可以作为性别区分的靶序列：s r y 基 因、z f y 基因、x y n 源的a m e l o g e n i n 基因及一些重复序列。由于雌雄个体的染 色体成分不同，所以通过对分布在性染色体上特定序列的扩增及比较，可以识别 动物的性别 2 7 29 1 。 5 粪便d n a 提取技术进展 5 1 样品采集 采集的粪便样品最好刚刚由排便者产下，因为若粪便在野外暴露时间过长， 粪便中脱落的肠道上皮细胞内的d n a 会在周围温度及湿度的影响下被核酸内切 酶大量降解，从而影响粪便d n a 的提取和p c r 扩增 3 0 】。若在野外进行采样中无 法获得刚产下的粪便，在野外暴露12 h ( s m i t he ta 1 ，2 0 0 0 ；n s u b u g ae la 1 ，2 0 0 4 ； c h a m b e r se t a l ，2 0 0 4 ) 甚至1 天的样品( m u r p h ye t a l ，2 0 0 0 ，2 0 0 2 ；v i d y ae t a l ，2 0 0 3 ； p i g g o re ta 1 ，2 0 0 3 ) 也能获得很好的试验结果【3 1 - 3 7 1 。 野外采样时并不总能发现动物排便，因此在采样时也可参考动物粪便的形 状、气味甚至p h 值来确定粪便的种类【3 ”。此外，了解动物行为对采样工作会有 很大帮助，例如，一些灵长类动物如大猩猩、短尾猴等常在早晨睡醒后排便，因 此早晨在其巢域可以采集到大量新鲜粪便样品。 采样时并不一定要采集整个粪便，对于大型哺乳动物的粪便，可以仅采集的粘膜 层或外层进行保存就足以供d n a 提取，这部分所含的细胞较多，同时杂质较少， 在提取时可以获得纯度很高的d n a 。采样过程中应使用一次性无菌供应品以防 止采样时的人为污染和样品间的交叉污染，并标明样品的种类、采集时间、采集 第一章前言 地点、采集者姓名以及采样时的天气( 温度和湿度) 。 5 2 样品保存 样品在采集后须尽快进行保存。由于核酸内切酶被认为是降解d n a 的主要 因素，因此大多数保存方法都是对粪便样品进行低温、脱水处理或将其保存在高 盐浓度缓冲液中以降低核酸内切酶活性【3 9 1 。目前常用的保存方法见表1 3 0 - 3 1 , 4 0 - 4 9 。 不同保存方法对可提取的d n a 质量有着较大影响，f r a n t z e n ( 1 9 9 8 ) 等在对 狒狒的粪便d n a 分析研究中发现，d e t s ( d m s 0 e d t a ，蹦s 盐溶液) 保存法对 核基因有着非常好的保存效果，而干燥保存法和乙醇保存法对线粒体d n a 及片 段小于2 0 0 b p 的核基因的保存有着较好的效果；在各种干燥保存方法中，冷冻 干燥保存的效果最好f 3 4 】。n s u b u g a ( 2 0 0 4 ) 在对大猩猩和黑猩猩的分子粪便学研 究中发现，将不同的保存方法结合起来使用，较单一的保存途径更加有效：先用 9 7 的乙醇浸泡粪便2 4 3 6 d , 时后再用二氧化硅干燥保存，其d n a 提取及p c r j ：f f 增效果明显超过了普通的二氧化硅保存法吲。 需要注意的是，在保存过程中必须添加足量的保存物质才能保证保存效果： 当保存物质的量不足时，保存液或干燥剂会因吸收了粪便中的大量水分而稀释或 潮湿，大大降低样品保存的效果。例如，在用无水乙醇保存粪便样品时，若添加 的无水乙醇量过少，会因无水乙醇被粪便所含水分稀释而大大降低保存效果；在 用二氧化硅干燥保存样品时，若二氧化硅添加量不够，也无法彻底干燥粪便中水 分。w a s s e r ( 1 9 9 7 ) 用4 倍于粪便质量的二氧化硅保存熊粪便，c o n s t a b l e ( 2 0 0 1 ) 用1 0 倍于粪便体积的无水乙醇保存黑猩猩的粪便，均获得了良好的保存效果 1 4 1 , 5 0 1 。 此外，在不同物种和生境之间，最适保存方法也是不同的。p i g g o t t ( 2 0 0 3 ) 等在澳大利亚2 种食草动物和3 种食肉动物的分子粪便学研究中发现干燥保存和 冷冻保存比乙醇和d e t s 保存有着更好的效果口7 1 ，这恰恰与f r a n t z e n ( 1 9 9 8 ) 和 m u r p h y ( 2 0 0 2 ) 的结论相反，前者在对狒狒粪便的d n a 提取研究中认为d e t s 是 上述4 种保存方法中保存核基因最有效的方法，而m u r p h y 在对棕熊粪便的d n a 提 取研究中发现乙醇保存比d e t s