河南省确山县第二高级中学高中生物 专题5《2多聚酶链式反应扩增DNA片段》教学案 新人教版选修1.doc

多聚酶链式反应扩增dna片段【教学目标】1、通过尝试pcr技术的基本操作，使学生体验pcr这一常规的分子生物学试验方法。2、理解pcr的原理，讨论pcr的应用。【知识梳理】 一、 基础知识（一）pcr原理1、dna复制参与的组分在dna复制中的作用解旋酶打开dna双链dna母链提供dna复制的模板_合成子链的原料dna聚合酶催化合成dna子链引物使dna聚合酶能够从引物的3端开始连接脱氧核苷酸（1）条件：（2）3端和5端： dna的两条链是反向平行的，通常将dna的羟基末端称为3端，而磷酸基团的末端称为5端。（3）dna聚合酶只能从3端延伸dna ，因此，dna复制需要引物。dna的合成方向总是从子链的5端向3端延伸。【注意】引物是dna或rna，用于pcr的引物长度通常为2030个核苷酸。2、解旋：在dna的复制过程中，双链的解开是dna复制的前提。在体外可通过控制温度来实现。3、pcr（1）概念：pcr的全称为多聚酶链式反应，是一种体外迅速扩增dna片段的技术。（2）dna的热变性原理：在80100的温度范围内，dna的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性；当温度缓慢下降后，两条被分离的dna链又会重新结合成双链，这个过程称为复性。（3）原理：dna的复制原理。（4）pcr反应条件： 缓冲溶液。dna模板。分别与模板dna两条模板链相结合的两种引物。四种脱氧核苷酸。耐热的dna聚合酶（一般用taq dna聚合酶）。能够自动调控温度的仪器：pcr仪。（5）pcr的反应过程: pcr一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。变性：当温度上升到90以上时，双链dna解聚为单链。复性：当温度下降到50左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链dna结合。延伸：当温度上升到72左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在dna聚合酶酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的dna链。（6）pcr的反应结果：从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物延伸而成的dna单链会与引物结合，进行dna的延伸，这样，dna聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的dna序列，使这段固定长度的序列成2n扩增。二、设计实验（一）制备固定化酵母细胞1、酵母细胞的活化：由休眠状态重新恢复为正常的生活状态。2、配制物质的量浓度为0.05mol/l的cacl2溶液。3、配制海藻酸钠溶液：海藻酸钠在水中溶解的速度较慢，需要通过加热促使其溶解。加热时最好采用小火间断加热的方法。如果加热太快，海藻酸钠会发生焦糊。4、海藻酸钠溶液与酵母细胞混合：将海藻酸钠溶液冷却至室温，加入已活化的海藻酸钠溶液，进行充分搅拌，使其混合均匀，搅拌后吸入到注射器中。5、固定化酵母细胞：将注射器中的混合液滴加到cacl2溶液中，形成凝胶珠状颗粒，在cacl2溶液中浸泡30min左右。（二）、用固定化酵母发酵1、将固定好的酵母细胞（凝胶珠）用蒸馏水冲洗23次。2、将10%葡萄糖溶液转移至锥形瓶中，加入固定好的酵母细胞，置于25 下发酵24h。（三）结果分析与评价1、观察凝胶珠的颜色和形状如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠浓度浓度偏低，该种凝胶珠包埋的酵母细胞数目较少，影响实验效果；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠浓度偏高，制作失败，需要再作尝试。2、观察发酵的葡萄糖溶液：利用固定的酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产生了很多气泡，同时会闻到酒味。（四）、课题延伸：工业生产中，细胞的固定化技术是在严格无菌的条件下进行的。（五）、归纳：1、加热使海藻酸钠溶化是操作中最重要的一步。海藻酸钠的浓度涉及固定化细胞的质量：如果海藻酸钠浓度过高，将很难形成凝胶珠；如果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目少影响实验效果。2、观察凝胶珠的颜色和形状：如果制作的凝胶珠颜色过浅，呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败。三、操作提示1、为避免外源dna等因素的污染，pcr实验中使用的 微量离心管、枪头、缓冲液 以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。2、pcr所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在-20储存。3、在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。所有的成分都加入后，盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击离心管的侧壁，使反应液混合均匀。4、混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。【典型例题】1.pcr技术扩增dna,需要的条件是(c)目的基因引物4种脱氧核苷酸dna聚合酶mrna核糖体a.b. c.d.2、引物的作用是（ d ） a打开dna双链 b催化合成dna子链c提供模板 d使dna聚合酶能够从引物的3端开始复制3、taqdna聚合酶的特点是（a ）a耐高温 b耐盐酸 c耐强碱 d不耐热4、标准的pcr过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是（ a ）a94 、55 、72 b72 、55 、92 c55、92 、72 d80 、55 、72 5、使用pcr仪的具体实验操作顺序应为( c )设计好pcr仪的循环程序按配方准备好各组分用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分进行pcr反应离心使反应液集中在离心管底部a.b. c.d.6、（ 2015年江苏，23）下列关于实验现象与结果的分析，错误的是 （bd）a组织切片上滴加苏丹染液，显微观察有橘黄色颗粒说明有脂肪b组织样液中滴加斐林试剂，不产生砖红色沉淀说明没有还原糖c洋葱表皮细胞滴加蔗糖溶液后，发生质壁分离说明细胞有活