（微生物学专业论文）产低温脂肪酶菌株的筛选及酶学性质研究.pdf

西川大学硕士学位论文 声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果 据我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文中不 包含其他人已经发表或撰写过的研究成果 也不包含为获得四川大学或其他 教育机构的学位或证书而使用过的材料 与我一同工作的同志对本研究所做 的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 本学位论文成果是本人在四川大学读书期间在导师指导下取得的 论文 成果归四川大学所有 特此声明 4 1 学生签名 望胡匆 导师签名 磊撕专 四川大学硕士学位论文 中文摘要 产低温脂肪酶菌株的筛选及酶学性质研究 微生物专业 研究生 董明奇指导老师 乔代蓉教授 脂肪酶是一类能催化长链甘油三酸酯水解反应的酶 由于酶技术的快速发 展 生物脂肪酶得到了广泛的关注 脂肪酶是一类重要的生物催化剂 在生物 技术方面有广泛的应用 目前工业上应用的脂肪酶大多是中温和高温脂肪酶 低温脂肪酶由于具有低温高催化活性等特点 在食品 洗涤 制药 脂类加工 等方面有着巨大的应用潜力 本文的目的在于筛选出产低温脂肪酶活力更高的 菌株 为今后生产上的应用提供出发菌株 供诱变 基因克隆等研究用 取得 成果如下 1 筛选得到8 0 余株产脂肪酶菌株 作者从成都及周边地区汽车修理厂 机油厂 植物油厂 餐厅 菜市场等 富含油脂的土壤中 用溴甲酚紫平板筛选得到8 0 余株产脂肪酶的菌株 其中大 部分酶活在1 0 2 0 u m l 范围内 2 筛选得到产低温脂肪酶的高产菌株0 6 0 8 0 5 挑选其中9 株酶活较高的菌株 对它们的酶学性质进行初步研究 菌株 0 6 0 8 0 5 和0 9 0 9 0 2 两株为产低温脂肪酶菌株 但是由于菌株0 6 0 8 0 5 酶活最高 因此选择该株做进一步研究 3 经过系统鉴定 确定菌株0 6 0 8 0 5 为短波单胞菌 b r e v u n d i m o n a s 菌株0 6 0 8 0 5 革兰氏染色阴性 菌落呈橙色 圆形 隆起 不透明 表面光 滑 湿润 边缘整齐 电镜观察呈短杆状 单鞭毛 接触酶和氧化酶阳性 不产生吲哚 不产生 脂酶 吐温一8 0 不液化明胶 只发酵麦芽糖 四川大学硕士学位论文 经1 6 sr d n a 序列比对 0 6 0 8 0 5 菌株与短波单胞菌属 b r e v u n d i m o n a s 的 1 6 sr r n a r d n a 序列一致性达到9 8 以上 因此确定菌株0 6 0 8 0 5 为短波单胞 菌 并命名为b r e v u n d i m o n a ss p 0 6 0 8 0 5 4 在国内首次报道了短波单胞菌具有产低温脂肪酶的能力 5 建立优化了菌株0 6 0 8 0 5 的发酵条件 对菌株b r e v u n d i m o n a ss p 0 6 0 8 0 5 的液体发酵条件进行优化 确定其最适发酵 培养基碳源为葡萄糖 氮源为蛋白胨 m f 浓度为0 0 5 发酵温度为2 8 发酵p h 为7 0 按1 5 接种量接种于最适发酵培养基中2 8 2 0 0 r p m 发酵4 8 h 酶活达到2 3 6 4 u m l 6 初步确定了菌株0 6 0 8 0 5 的酶学特性 对菌株b r e v u n d i m o n a ss p 0 6 0 8 0 5 所产的脂肪酶进行酶学性质研究 该酶最 适反应温度为3 5 c 最适p h i 0 6 0 属于低温酸性脂肪酶 该酶具有较好的热稳定 性 在6 0 下处理6 0 m i n 酶活力基本不变 本文首次报道了短波单胞菌可以产低温脂肪酶 并对其产酶条件及酶学特 性进行了初步研究 为今后生产上的应用提供基础 可进行诱变和基因克隆的 出发菌株 进行进一步研究 关键词 脂肪酶 短波单胞菌 分离鉴定 发酵条件 酶学性质 2 四川大学硕士学位论文 a b s t r a c t s c r e e n i n go fl i p a s ep r o d u c i n gs t r a i n sa n ds t u d i n go n p r o p e r t i e so fl i p a s e m a j o r m i c r o b i o l o g y p o s t g r a d u a t e d o n gm i n g q it u t o r q i d a l r o n g l i p a s e s a r eac l a s so fe n z y n l e sw h i c hc a t a l y s et h eh y d r o l y s i so fl o n gc h a i n t r i g l y c e r i d e s m i c r o b i a ll i p a s e sa r ec u r r e n t l yr e c e i v i n gm u c ha t t e n t i o nw i t ht h er a p i d d e v e l o p m e n to fe l l z y l n et e c h n o l o g y l i p a s e sc o n s t i t u t et h em o s ti m p o r t a n tg r o u po f b i o c a t a l y s t sf o rb i o t e c h n o l o g i c a la p p l i c a t i o n s o i l ys o i ls a m p l e sw e r ec o l l e c t e d a b o m 8 0s t r a i n sp r o d u c i n gl i p a s ew e r ei s o l a t e d b ys m d y i n gt h ee n z y m a t i cc h a r a c t e r i s t i c s o f 9s t r a i n sh i g h l yp r o d u c i n gl i p a s e t h e nc h o o s et h es t r a i n0 6 0 8 0 5f o rf u r t h e rs t u d y t h es t r a i n0 6 0 8 0 5i si d e n t i f i e da sb r e v u n d i m o n a sb y1 6 sr d n as e x l u e n c ea n a l y s e a n de h a r a c t e r i s t e ro fp h y s i o l o g ya n db i o c h e m i s t r y t h e nn a m e da sb r e v u n d i m o n a s s p 0 6 0 8 0 5 s t u d y i n go nt h ee f f e c t so fn i t r o g e ns o u r c e s c a r b o ns o u r c e sa n do t h e ri n f l u e n c c f a c t o r sh a so p t i m i z e dt h el i p a s ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sf o rt h es t r a i n t h eo p t i m a l n i t r o g e n s o u r c ei s t r y p t o n e t h eo p t i m a l c a b o l ls o u r c ei s g l u c o s e t h eo p t i m a l c o n d i t i o nf o rl i p a s ep r o d u c i n ga r em o c u l a t i o nf o r1 5 i n i t i a lp h 7 0 c l u t i v a t e d a e r o b i c a l l ya t2 8 cw i t ha na e r a t i o nr a t eo f2 0 0 r p mf o r4 8h o u r s t h e na m a x i m u m y i e l do f 2 3 6 4 u m lw a so b t a i n e d b ys t u d y i n gt h ee n z y m a t i cc h a r a c t e r i s t i c s t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r ea n dp hf o ri t w e r e3 5 ca n d6 0 t h ee n z y m ea c t i v i t yw a ss t a b l ea f t e ri n c u b a t e di nt h et e m p e r a t u r e r a n g ef r o m3 0 6 0 f o r6 0 m i n 3 四川大学硕士学位论文 k e yw o r d s l i p a s e b r e v u n d i m o n a s 够 s c r e e n i n g f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n e n z y m o l o g yp r o p e r t y 4 四川大学硕士学位论文 刖吾 脂肪酶 l i p a s e e c3 1 1 3 是一类在油 水界面上催化天然油脂 甘油三脂 降解为甘油和游离脂肪酸的酶 广泛存在于植物 动物和微生物中 大多数工 业用脂肪酶来自微生物 脂肪酶在工业上应用广泛 可用于油脂分解 食品风 味和香味的改进 洗涤剂和化妆品的添加剂 医疗和皮革脱脂 低等油脂的改 性等 u 于国外相比 国内脂肪酶的研究起步比较晚 工业化的微生物脂肪酶 制剂种类有限 因此 筛选具有新特性的活力高 产量高及成本低的脂肪酶菌 种 这对开发脂肪酶新的应用领域是很重要的 目前工业上应用的脂肪酶大多是中温和高温脂肪酶 它们大多由微生物产 生 且基本上为胞外酶 产酶的最适温度多在3 0 以上 而酶的最适反应温度 一般在4 0 左右或更高 在0 c 附近普遍丧失活性 3 低温脂肪酶的最适反应 温度一般均低于4 0 而在0 c 仍具高酶活 低温脂肪酶在造纸工业中应用可减 少加热与冷却的步骤 可以作为洗涤添加剂提高常温条件下洗涤剂的洗涤效果 近年来 脂肪酶的研究主要集中在对它的结构鉴定 动力学机制 基因测 序及基因克隆等方面 而对工业上可利用的脂肪酶生物反应体系的研究相对比 较少 本研究的目的是经过大量的筛选工作得到产脂肪酶的菌株 并从中挑选出 产低温脂肪酶的菌株进行进一步研究 为今后生产上的应用提供一定的基础 可作为出发菌株 供诱变 基因克隆等研究之用 四川大学硕士学位论文 第一章产脂肪酶菌株的筛选 脂肪酶 甘油酯水解酶 l i p a s e e c 3 1 1 3 全称t d a e y l g l y c e m l a c y l h y d r o l a s e 是分解脂肪的酶 它是一类特殊的酯键水解酶 广泛存在于动物 植物和微生物中 催化天然底物油脂 甘油三酯 水解为游离脂肪酸 甘油二 酯 甘油单酯 其天然底物一般为不溶于水的长链脂肪酸酰基酯 几乎所有的微生物都具有合成脂肪酶的能力 但是合成能力却有差异 因 此 要达到工业化生产微生物脂肪酶的目的 首先必须筛选与所需酶学性质相 符的高产菌株 或构建高表达量的重组基因工程菌株 脂肪酶产生菌主要从自 然界中筛选 其筛选方法一般是 样品经富集培养 平板筛选 观察变色圈大 小 最后经摇瓶复筛 测酶活力大小 本章的目的在于从含油土壤中分离筛选出产脂肪酶活力较高的菌株 对其 酶学特性进行初步研究 筛选产低温脂肪酶的菌株进行进一步的研究 1 材料和方法 1 1 试验材料 1 1 1 主要试剂 试验常用生化试剂 均为分析纯 橄榄油 o l i v e o i l 中国医药 集团 上海化学试剂公司 聚乙烯醇 p v a 中国医药 集团 上海化学试剂公司 溴甲酚紫 1 1 2 仪器设备 h 1 6 5 0 w 台式微量高速离心机 d k 8 d 型电热恒温水槽 h z q q 全温振荡器 h z q 1 0 0 振荡培养箱 p y x d h s 4 0 x 5 0 隔水式 电热恒温培养箱 6 长沙湘仪离心机仪器有限公司 上海精宏实验设备有限公司 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司 哈尔滨市东联电子技术开发有限司 上海市跃进农场医疗器械厂 四川大学硕士学位论文 b s l l 0 s 电子天平 b l 6 0 0 电子天平 l d z x 5 0 k b s 立式压力蒸汽灭菌器 s w c t 1 c 无菌操作台 l g 微波炉 美的电磁炉 海尔电冰箱 北京赛多利斯天平有限公司 北京赛多利斯天平有限公司 上海申安医疗器械厂 苏州安泰空气技术有限公司 1 2 土样采集 采集成都周边汽车修理厂 机油厂 植物油厂 餐厅 菜市场等油污丰富的 土壤 供分离用 1 3 培养基 1 3 1 富集培养基 酵母膏 0 2 9 n a 2 h p 0 4 k h 2 p 0 4 1 5 9m g s 0 4 7 h 2 0 n a c l 0 5 9 橄榄油 蒸馏水 1 0 0 0 m l 调p h6 0 1 0 0 1 2 1 灭菌2 0 m i n 1 3 2 种子培养基 葡萄糖 2 0 9 n h 4 h s 0 4 k 2 h p 0 4 0 1 9m g s 0 4 7 h 2 0 蛋白胨 2 5 9橄榄油 蒸馏水1 0 0 m l 调p h 7 0 1 1 5 灭菌2 0 m i n 1 3 3 发酵培养基 蛋白胨 2 o g 橄榄油 1 0 m l 蔗糖 n h 4 2 s 0 4 3 5 9 0 5 9 1 0 m l 0 5 9 0 0 5 9 1 0 m l 0 5 9 0 1 9 四川大学硕士学位论文 m g s 0 4 7 1 1 2 00 0 5 9k 2 h p 0 4 0 1 9 蒸馏水 1 0 0 m l p h 自然 1 1 5 c 灭菌2 0 m i n 1 3 4 平板初筛培养基 牛肉膏 o 5 9蛋白胨 1 o g n a e l o 5 9葡萄糖o 3 9 琼脂粉 1 5 9 tween8 0 o 5 m l p v a 1 0 9橄榄油 2 5 m l 指示剂蒸馏水 1 0 0 m l 调p h 6 0 1 0 0 1 2 1 灭菌2 0 r a i n 平板筛选培养基的配制方法 1 称取牛肉膏5 9 蛋白胨1 0 9 n a c l5 0 9 葡萄糖3 0 9 溶于8 0 0 m l 去离子水中 充分溶解后 用n a o h 调p h 6 o 一1 0 0 2 称取琼脂粉15 o g t w e e n8 05 0 9 p v a io 0 9 橄榄油2 5 0 m l 分 蹦溶于上述溶液中 加热使琼脂粉溶解 用去离子水定容到1 0 0 0 m l 1 2 1 灭 菌2 0 m i n 3 待培养基冷却到6 0 加入指示剂 无菌条件下乳化倒平板 以溴甲酚紫为指示剂的油脂平板筛选法 称量溴甲酚紫0 1 9 溶于2 5 0 m l 含 1 8 5 m lo 1 m o l ln a o h 的水中即成 其由酸到碱的颜色变化为黄一紫 变色范 围为p h 5 2 6 8 过滤除菌后取o 4 m l 加入己灭好的1 0 0 m l 初筛培养基中 1 4 方法 1 4 1 富集培养 称取土样2 9 悬浮于2 0 t r d 无菌水中 振荡制成土壤悬液 取每种土壤悬液 3 m l 加入到装有3 0 m l 富集培养基的三角瓶中 将三角瓶置于3 0 c 摇床振荡培养 3 d 后 无菌操作转接3 0 0 u l 浑浊的菌液到新鲜的液体富集培养基 连续富集3 轮 1 4 2 初筛培养 四川大学硕士学位论文 从富集培养基三角瓶中各取1 0 0 u 菌悬液用无菌水进行系列梯度稀释 稀 释后取l o 1 0 一 1 0 7 三种梯度涂布初筛平板 3 0 温箱培养3 5 d 后观察 变色圈大小 1 4 3 复筛培养 初筛培养后 根据初筛培养基上菌落周围变色圈的大小 挑取变色圈大的 菌落划线分纯 将分纯后的菌株转接到种子培养基中 1 的接种量 3 0 2 0 0 r p m 培养2 4 h 之后转接到发酵培养基中 3 0 c 2 0 0 r p m 培养4 8 h 1 4 4 脂肪酶活力测定 采用橄榄油乳化法 发酵液1 0 0 0 0 r p m2 0 r a i n 取上清测酶活 1 反应乳化液的配制 取4 5 v a 加1 0 0 m l 水 加热溶解 冷却后用 6 m o l l n a o h 调至8 0 过滤 定容为1 5 0 m l 加入橄榄油5 0 m l 用高速组织捣 碎机搅拌1 0 m i n 前后各5 m i n 间隔5 m i n 备用 2 0 0 5 m o l l 甘氨酸一n a 0 h 缓冲液的制备 称取1 8 8 9 甘氨酸 加入 4 8 0 m l 水 用6 m o l l n a o h 调p h 8 0 定容至5 0 0 m l 备用 需新鲜配制 3 0 0 5 m o l l n a o h 溶液的制备 取4 5 8 9 固体n a o h 溶于l l 水中 用 邻苯二甲酸氢钾标定 使用时稀释l 倍 4 l 酚酞做指示剂 9 5 乙醇作反应中止剂 橄榄油乳化液5 m l o 0 5 m o l l 甘氨酸一n a o h 缓冲液4 m l 稀释的待测酶 液l m l 取1 0 0 m l 三角瓶2 只 分别加入上述反应液 3 5 水浴反应1 0 m i n 后 加待测酶液前需预热5 m i n 左右 加入1 5 m 1 9 5 乙醇中止反应 取出 于空 白和样品中各加入2 滴酚酞作指示剂 用0 0 5 m o l l n a o h 标准溶液滴定 直至 微红色并保持3 0 s 不退色为终点 记录消耗的n a o h 体积 对照组的乙醇中止 剂应在加入酶液之前加入 酶活计算 u v v 0 x 5 0 x r g t u 一样品的酶活力 v 一滴定样品时消耗o 0 5 m o l l n a o h 标准溶液的体积 v 0 一滴定对照时消耗的0 0 5 m o l ln a o h 标准溶液的体积 5 0 o 0 5 m o l ln a o h 标准溶液1 0 0 m l 相当于5 0 u m o l 脂肪酸 9 四川大学硕士学位论文 n 一酶液稀释倍数 t 一反应时间 m i i l 在初步测定酶学性质时 所选温度2 0 7 0 c p h 4 1 0 2 结果 2 1 采样结果 在成都及周边的汽车修理厂 机油厂 植物油厂 餐厅 菜市场等油污丰 富的土壤 共采集2 3 个样本 2 2 初筛结果 用无菌水稀释富集后的样品 稀释梯度为1 0 一 1 0 一 1 0 1 0 一 置于 3 0 c 培养箱培养1 3 d 后 筛选到水解圈与菌落直径比值较大的菌株 划线纯化 挑取单菌落于种子培养基中 3 0 摇床培养2 4 h 甘油一2 0 保种 斜面4 c 保 种 2 3 复筛结果 将初筛得到的菌株以1 的接种量接种到种子培养基中 3 0 c 2 0 0 r p m 摇 床培养2 4 h 再以1 的接种量转接到发酵培养基中 3 0 c 2 0 0 r p m 摇床培养 4 8 h 取发酵液1 0 0 0 0 r p m 离心3 0 m i n 取上清测定酶活 菌株复筛部分菌株酶 活见表1 1 表1 1 部分菌株酶活统计表 1 0 四川大学硕士学位论文 2 4 酶学性质初步研究结果 挑选初筛和复筛结果相同的酶活较高的9 株菌 对其酶学性质做初步研究 结果如表1 2 表1 2 菌株酶学特性统计表 菌株编号 酶作用的最适p h 酶作用的最适温度 0 6 0 8 0 56 03 5 0 9 0 9 0 28 03 0 1 0 1 0 2 51 0 05 5 0 9 0 9 1 36 06 0 1 0 1 0 1 8 1 0 0 6 0 四川大学硕士学位论文 经过富集 初筛 复筛等过程 用溴甲酚紫平板从富含油脂的土壤中筛选 得到产脂肪酶的菌株 其中大部分的酶活都在1 0 2 0 u m l 之间 对其中的9 株进 行了初步的酶学特性研究 其中2 株为产低温脂肪酶菌株 其他作用温度都较高 4 株产酸性脂肪酶 5 株产碱性脂肪酶 其中0 6 0 8 0 5 酶活最高 并且最适反应温 度较低 3 5 最适反应p h6 0 为酸性 因此该酶属于低温酸性脂肪酶 因 此选择该菌株 对其产酶条件进行优化 对其酶学特性进行进一步研究 为今 后生产上的应用提供一定的基础 可作为出发菌株 供诱变 基因克隆等研究 之用 1 2 四川大学硕士学位论文 第二章产脂肪酶菌株的鉴定 脂肪酶在微生物中广泛分布 目前 报道的产脂肪酶的菌株很多 其中包 括假单胞菌 链霉菌 丝胞酵母 假丝酵母 黑曲霉 根霉 不动杆菌 类产 碱假单胞菌等 本章的目的在于对所分离的菌株0 6 0 8 0 5 进行生理生化鉴定及 1 6 sr d n a 鉴定 从而确定所分离到的菌的种属 1 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 菌株 菌株0 6 0 8 0 5 1 1 2 溶液和试剂 1 革兰氏染色试剂 结晶紫液 h u c k e r 配方1 a 液 结晶紫2 0 99 5 乙醇 2 0 m l b 液 草氨酸 0 5 9 蒸馏水8 0 m l 将a b 两液相混合 静置4 8 h 后使用 染色液应放置棕色瓶中保存 卢哥尔 l u 9 0 1 l 毛碘液 碘片 1 o g 碘化钾 2 o g 蒸馏水3 0 0 m l 先用少量蒸馏水溶解碘化钾 再投入碘片 直至碘片全部溶解后 加入蒸 馏水定容至3 0 0 m l 放置棕色瓶可保存数月 2 5 番红乙醇溶液 番红 2 5 9 9 5 乙醇 1 0 0 m l 复染剂保存于棕色瓶中 用复染剂 2 5 番红乙醇溶液 与蒸馏水1 4 混合 四川大学硕士学位论文 即得到革兰氏染色所需的o 5 番红水溶液 2 接触酶反应的试剂 3 1 0 过氧化氢 3 芽孢染色液 孔雀绿染液 孑l 雀绿 m a l a c h i t eg r e e n 5 o g蒸馏水 o 5 番红溶液 4 甲基红试验试剂 甲基红 0 i g 9 5 y 醇 蒸馏水2 0 0 m l 5 v p 试验试剂 肌酸0 3 或原粉4 0 n a o h 6 硝酸盐还原和亚硝酸还原试验试剂 格里斯 g r i e s s 试剂 a 液 对氨基苯磺酸 b 液 萘胺 蒸馏水 二苯胺试剂 0 5 9 o 1 9 2 0 m l 稀醋酸 1o 左右 15 0 r a l 稀醋酸 1 0 左右 1 5 0 r a l 二苯胺0 5 9 溶于l o o m l 浓硫酸中 用2 0 m l 蒸馏水稀释 7 吲哚试验试剂 对二甲基氨基苯甲醛 p a r a d i m e t h y l a m i n o b e n z a l d e h y d e 9 5 乙醇7 6 0 m l浓h c l 8 l 溴百里酚蓝试剂 8 0 9 1 6 0 m l 漠百里酚蓝 1 9蒸馏水 1 0 0 m l 溴百里酚蓝先用少量9 5 乙醇溶解后再加水配成1 浓度 用棕色瓶保存 9 产氨试验试剂 将2 0 9 碘化钾溶于5 0 m l 水中 并在此溶液中加碘化汞小粒至溶液饱和为止 此后再加4 6 0 m l 水和1 3 4 9 氢氧化钾 将上清液贮存于暗色瓶中备用 1 0 氧化酶试验试剂 1 4 呲 o 四川大学硕士学位论文 盐酸二甲基对苯撑二胺1 水溶液于茶色瓶中在冰箱中贮存 1 1 3 分类鉴定培养基 1 葡萄糖氧化发酵培养基 蛋白胨 2 9 n a c l 5 9 k 2 h p 0 4 o 2 9葡萄糖 1 0 9 琼脂 5 6 9 l 溴百里酚蓝水溶液3 m l 蒸馏水1 0 0 0 m l 调节p h 7 0 7 2 分装试管 1 1 5 灭菌2 0 m i n 备用 溴百里酚蓝先用少量 9 5 乙醇溶解后再加水配成1 浓度 2 糖醇发酵试验培养基 n h 4 2 h p 0 4l g酵母膏0 2 9 m g s 0 4 7 h 2 00 2 9 k c i o 2 9 糖或醇类 1 0 9琼脂 5 9 0 4 溴甲酚紫乙醇液2 m l 蒸馏水1 0 0 0 m l 糖或醇类为d 葡萄糖 d 木糖 蔗糖 麦芽糖 乳糖 半乳糖 d 甘露 醇 d 阿拉伯糖 d 山梨醇等 调节p h 7 0 7 2 分装试管 每管装4 5 c m 高 1 1 5 灭菌2 0 r a i n 3 甲基红和v p 试验培养基 蛋白胨 5 9葡萄糖 5 9 k 2 h p 0 4 5 9 水 1 0 0 0 m l p h 7 0 7 2 每管分装4 5 m l 1 1 5 c 蒸气灭菌3 0 m i n 4 淀粉水解试验培养基 蛋白胨 1 0 o g牛肉膏3 0 9 n a c l 5 0 9可溶性淀粉2 o g 蒸馏水1 0 0 0 m l 调节p h 7 2 7 4 固体培养基加琼脂1 5 0 9 1 2 1 灭菌2 0 m i n 后倒平板 5 硝酸盐还原试验培养基 蛋白胨 l o o g n a c l 5 o g 1 5 四j l l 大学硕士学位论文 牛肉膏 3 o gk n 0 3 蒸馏水1 0 0 0 m l 调节p h 7 2 7 4 分装试管 1 2 1 灭菌2 0 m i n 6 亚硝酸还原试验培养基 牛肉膏l o g 蛋白胨 n a n 0 2 l g 蒸馏水 p h 7 2 7 4 分装试管 1 2 1 灭菌1 5 r a i n 7 产氨试验培养基 蛋白胨 5 9 蒸馏水 1 0 0 0 m l p h 7 2 分装试管 1 2 1 灭菌1 5 r a i n 8 吲哚试验培养基 1 0 9 5 9 1 0 0 0 m l 蛋白胨 1 0 9 蒸馏水 1 0 0 0 m l 调p h 7 2 7 6 将培养基分装1 3 1 4 试管 1 1 5 c 灭菌3 0 m i n 9 明胶液化试验培养基 明胶 1 0 0 1 5 0 9 蛋白胨 5 9 蒸馏水1 0 0 0 m l 调节p h 7 2 7 4 分装试管 培养基高度约4 5 c m 1 1 5 c 灭菌2 0 m i n 1 0 脂酶 吐温 8 0 试验培养基 蛋白胨 1 0 9 n a c l 5 9 c a c l 2 7 h 2 0 0 1 9 琼脂 9 9 蒸馏水 1 0 0 0 m l p h 7 4 于1 2 1 灭菌2 0 m i n 底物吐温 8 0 于1 2 1 灭菌2 0 m i n 冷却培养基 于4 0 5 0 c 加吐温 8 0 至终浓度为l 倒平板 1 2 方法 1 2 1 革兰氏染色 取无油迹的干净载波片 滴上一滴无菌蒸馏水 用接种环挑取少许菌苔 于水滴边缘轻轻涂几下 自然风干 或在火焰上通过几次 固定涂片 滴加结晶紫液 染一分钟 用水冲净结晶紫液 1 6 四川大学硕士学位论文 滴加碘液 覆盖约i m i n 用水冲去碘液 将片上的水甩干 滴加9 5 乙醇液脱色 并立即用水冲净乙醇 番红液染1 2 r a i n 用水洗净 风干 用显微镜油镜观察涂片 菌体红色为革兰氏染色阴性 蓝紫色为革兰氏染色阳性 同时做大肠杆菌 阴性对照和金黄色葡萄球菌阳性对照 1 2 2 接触酶试验 将2 4 h 培养的斜面菌种 以铂丝接种环取 d 环涂抹于已滴有3 过氧化氢 的玻片上 如有气泡产生则为阳性 无气泡为阴性 1 2 3 葡萄糖氧化发酵 接种 以2 4 h 菌种做种子 穿刺接种 每株4 支 其中2 支用灭菌的凡士林石 蜡油 溶化2 3 凡士林中加入1 3 液体石蜡 高压灭菌 封盖 约0 5 1 c m 厚 以 隔绝空气为闭管 另2 支不封油为开管 同时有不接种的闭管和开管作对照 适 温培养1 2 3 7 1 4 d 观察结果 结果检查 只有开管产酸变黄者为氧化型 开管和闭管均产酸变黄者为发 酵型 1 2 4 糖醇发酵试验 将2 4 h 斜面培养物穿刺接种于培养基中 适温培养1 3 5 d 后观察 如指示 剂变黄 表示产酸 为阳性 不变或变蓝 紫 则为阴性 1 2 5 甲基红试验 接种 接种菌种于培养液中 每次2 个重复 适温培养2 6 d 观察结果 在培养液中加入一滴甲基红试剂 红色为甲基红试验反应阳性 黄色为阴性 1 2 6v p 试验 培养于接种同甲基红试验 取培养液和4 0 氢氧化钠等量混合 加入少许 肌酸 l o m i n 女n 培养液出现红色 即为试验阳性反应 四川大学硕士学位论文 1 2 7 芽孢染色 将生有芽孢的斜面菌苔按革兰氏染色法涂片 用饱和的孔雀绿水溶液染 l o m i m 用自来水冲洗 用o 5 番红液复染l m i n 水洗 吸干 待干燥后 置油镜观察 芽孢呈绿色 菌体呈红色 1 2 8 氧化酶试验 在干净的培养皿中放一张滤纸 滴上二甲基对苯撑二胺的1 水溶液 仅使 滤纸湿润 用白金丝接种环取2 4 h 的菌苔 涂抹在湿润的滤纸上 在1 0 s e c 内 涂抹的菌体出现红色者为阳性 1 0 6 0 s e e 出现红色者为延迟反应 6 0 s e e 以上出 现红色者按阴性处理 1 2 9 淀粉水解试验 取新鲜斜面培养物点种于培养基上 适温培养2 5 d 形成明显菌苔后 在 平板上滴加碘液平板呈蓝黑色 菌落周围如有不变色透明圈 表示淀粉水解阳 性 仍是蓝黑色为阴性 1 2 1 0 硝酸盐还原试验 将菌种接种于硝酸盐液体培养基中 置适温培养1 3 5 d 每株菌做2 个重 复 另留两管不接种的做对照 取两支干净的空试管倒入少许培养1 3 5 d 的培养液 再各加入一滴a 液 和b 液 在对照管中同样加入a 液和b 液 当培养液加入a b 液后 溶液变为粉红色 玫瑰红色 橙色 棕色等为硝 酸盐还原阳性 如无红色出现 再加入一 二滴二苯胺试剂 此时如呈蓝色 为硝酸盐还原反应阴性 如不呈蓝色反应 按照硝酸盐还原阳性处理 1 2 1 1 产氨试验 四川大学硬士学位论文 接种后置适温培养1 3 5 d 取少许培养液 加入试剂 出现黄褐色沉淀 为阳性 1 2 1 2 亚硝酸还原试验 接种后在3 0 培养1 3 7 d 测定 加试剂a 液和b 液各一滴 如红色消 失而产氨为阳性 如加试剂为红色为亚硝酸还原阴性 1 2 1 3 脲酶试验 将测定菌株接种在营养琼脂斜面上 在第3 d 和第7 d 进行脲酶的测定 在 空试管中将斜面菌苔做成2 m l 浓菌悬液 加入一滴酚红指示剂 调p h7 即酚 红刚刚转黄里橙红色 将此菌悬液分成两份 在其中一管中加入0 1 9 尿素 另 一管不加尿素作为对照 如加尿素的试管几分钟变红 为脲酶阳性 不变者 则为阴性 1 2 1 4 吲哚试验 取培养1 2 4 7 d 的培养液 加入4 5 滴乙醚至培养液中 摇动 使乙 醚分散于液体中 将培养物静置片刻 待乙醚浮至液面后沿管壁缓缓加入3 5 m m 高的吲哚试剂于培养液表面 在液层界面出现红色为阳性反应 1 2 1 5 明胶水解试验 将测试菌接种于明胶水解培养基中 在2 0 培养 2 3 d 后在2 0 以下观察 结果 如明胶凝块部分或是全部在2 0 下变为可流动的液体 则为明胶水解阳 性 如菌已生长 明胶表面无凹陷且为稳定的凝块 则为明胶水解阴性 如菌 已生长 明胶未液化 但是明胶表面菌苔下出现凹陷小窝 需与未接种的对照 管相比较 因为培养过久的明胶因水分流失也会发生凹陷 也是轻度水解 按 阳性记录 而对于在2 0 下不能生长的菌种 可在适温下培养生长后 放入4 冰箱 或冰浴中1 观察培养基还能不能凝固 不能凝固者为明胶水解阳性 能凝 固者为阴性 1 2 1 6 脂酶 吐温一8 0 试验 1 9 四j l f 大学硕士学位论文 划线接种培养物于平板 培养至7 d 每天观察 如果在生长的周围有模糊 的晕圈者为阳性 没有晕圈者为阴性 1 2 1 7 菌株培养及总d n a 的提取 采用c t a b 法提取菌株基因组d n a 图2 1 将冷冻保存的菌株0 6 0 8 0 5 接种于l b 液体培养基中置3 7 c 培养2 4 h 取1 5 m l 菌体培养物 5 0 0 0 r p m 离 心5m i n 收集菌体 去尽培养液 在沉淀中加入5 6 7 m l 的t e 缓冲液 用吸管 反复吹打 使之重悬 然后加入3 0 u l1 0 s d s w v 和3 u l2 0 m g m l 蛋白酶k 混 匀 于3 7 水浴保温1 h 再加入1 0 0 u l1 0 m o l l c t a b 溶液 4 1 9 n a c l 溶于8 0 m l 水中缓慢加入c t a b1 0 曲及1 0 0 u l 浓度为0 7 m 0 1 l n a c l 溶液 混匀 6 5 水浴 保温1 0 m i n 得到粗提取液 在此粗提取液中加入等体积的酚 氯仿 异戊醇 2 5 2 4 1 v 颠倒混匀 1 2 0 0 0 r p m 离心5 m i n 取上清 并加入等体积的氯仿 异戊 醇 2 4 1 v 颠倒混匀 1 2 0 0 0 离心5m i n 弃下层 重复2 次 在第二次所得 到的上清中 加入0 6 倍体积的冷的异丙醇 轻轻混合 直到d n a 沉淀下来 1 2 0 0 0 r p m 离心5m i n 弃去上清 得到d n a 沉淀 用l m l7 0 的乙醇 v v 洗涤 d n a 沉淀2 次 并在空气中自然干燥 最后用1 0 0 u 1 t e 缓冲液溶解d n a 并 加入适量r n a s e 置于 2 0 保存 2 0 四川大学硕士学位论文 s i i n 加5 a t i s j t 霉缀冲波 1 4 1 枪些殷篮蛾 f 藏躲沉淀 i3 山徼f l 脯i c m m l c m l 3 0 阻1 0 s 3 7 c 魏 i 磕l h 0 黼体裂勰液 ll o o lc t j k b 1 0 0 l o m m 疽 c 1 一 f 缳溢加一 糍拯瑕潍 上7 0 0 皿 鼢 缀协 辩j 踅孵 搿 鹚泓盘j 1 2 0 0 0 f p m 觚 擎淑 0 7 0 0 l s a 锰伯 婷 靶孵 瀚溺泓匀 毒 o f p 细 自潜i 攫 l5 0 0 州l 辩w 擀 12 0 0 0 r p m 5 m 1 o 纳厶孵洗涤 一缀 列辩 图2 1 提取细菌基因组流程圉 1 2 1 81 6 sr d n ap c r 扩增 扩增引物 1 6 sr d n a 扩增引物采用通用引物 f g a g l l t g a t c c t g g c t c a g r a g a a a g g a g g t g a t c c a g c c 由i n v i t r o g e n 公司合成 p c r 扩增片段约为1 5 0 0 b p 扩增体系以及循环参数 将上述制备的基因组d n a 作为p c r 扩增的模板 采用5 0 u l 反应体系 表 2 l 四川大学硬士学位论文 2 1 进行p c r 扩增 为了防止单引物扩增 加入单引物作为对照 表2 1p c r 扩增体系 p c r 程序如下 9 4 3 0 s e e 9 4 c3 0 s e c 5 9 c3 0 s e c 0 7 2 2 m i nj 9 4 3 0 s e c 5 8 3 0 s e c卜 7 2 2 m i n 4 个循环 4 个循环 9 4 3 0 s e e 5 7 c3 0 s e c 4 个循环 7 2 2 m i n j 9 4 3 0 s e e 5 6 c3 0 s e c l2 3 个循环 7 2 2 m i n j 7 2 1 0 r a i n p c r 产物检测 预先制备1 o 的琼脂糖凝胶 扩增反应完毕后 取5 u l 的p c r 产物与3 u l 四川大学硕士学位论文 6 xl o a d i n g b u f f e r 混合 加样于琼脂糖凝胶点样孔中进行电泳 电压8 0 v 电泳 液为0 5 x t b e 电泳后 紫外灯下观察 如果p c r 成功 则可见到约为1 5 0 0 b p 的条带 1 2 1 9 目的片段的回收 采用o m e g a p 技回收试剂盒 1 1 使用t b eb u f f e r 新鲜的b u f f e r 以避免影响胶回收量 2 避免u v 照射3 0 s e e 以上 在观察室中进行切胶 3 切下的胶放入干净的1 5 m l e p 管中 假设胶的密度为1 9 m l 即0 2 9 胶 等于0 2 m l 凝胶体积 加入b i n d i n g b u f f e r1 2 倍体积 5 5 6 0 0 水浴7 m i n 直至胶完全溶解 每隔2 3 r a i n 摇晃均匀 4 将上述溶解液转入收集柱中离心 室温离心1 2 0 0 0 r m pl m i n 5 弃液体 加入3 0 0 u lb i n d i n gb u f f e r 1 2 0 0 0 r p ml m i n 6 加入7 0 0 u ls p w b u f f e r 用前用乙醇稀释 2 8 0 i l ls p w b u f f e r 1 1 2 0 u l 无 水乙醇 放置2 3 m i n 1 0 0 0 0 r p ml m i n 7 弃液体 重复步骤5 8 弃液体 将吸附柱放入空管 再1 0 0 0 0 r p ml m i n 离心 9 将吸附柱转入干净的1 5 m l e p 管 加入3 0 u l d n a 溶解液 放置1 2 m i n 1 0 0 0 0 r p m 离心l m i n 1 0 将离心后的液体重新吸入吸附柱中 再离心一次 1 2 2 0 连接 p c r 扩增产物与质粒载体p m d1 8 一t 参照使用说明进行连接 其连接体系 为 p c r 产物 根据p c r 产物的浓度而定 4 0 u l p m d1 8 t 1 0 u l 2 l i g a t i o ni 5 0 u l 共1 0 u l 1 6 0 保温3 0 m i n 1 2 2 1 感受态细胞的制备 四川大学硕士学位论文 1 将e c o t i 接种于l b 液体培养基中 3 7 摇床培养过夜 然后在l b 琼 脂板上划线培养 2 次日以1 接菌量 将5 m l 培养液接入5 0 m l 新鲜的l b 液体培养基中 3 7 摇床培养2 3 h 至o d 6 0 0 达到0 6 3 在无菌条件下 将培养物转移至冰冷的5 0 m l 离心管中 冰浴10 m i n 4 4 4 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n 收集细胞 去尽上清液 5 1 将沉淀重悬于1 5 m l 冰冷的t bb u f f e r 中 置冰浴上1 0 m i n 6 重复 4 到 5 步骤 7 将沉淀块轻轻的重悬于4 m l t b b u f f e r 现配 中 加入2 8 0 u l d m s o 然后摇晃使终浓度为7 8 在冰上至少放置1 0 m i n 分装感受态于e p 管中 置于液氮中至少5 m i n 1 2 2 2 转化 1 将冻存的感受态细胞 从 7 0 取出 放在冰水上使其融化 2 0 0 u l 感受 态细胞中加入1 0 u l 连接反应产物 轻轻混匀 冰水中放置3 0 r a i n 2 1 将e p 管在4 5 热水浴中热激活3 0 s e e 3 迅速将管放入冰水中 静置2 3 m i n 4 加入l m l 液体l b 培养基 3 7 c 摇床培养6 0 r a i n 5 将l m l 培养液5 0 0 0 r p m 离心5 m i n 用剩下的约1 0 0 u l 上清重悬菌体 涂布于预先倒好的含a m p 的l b 固体培养基上 置于3 7 c 温箱中过夜 培养 1 2 2 3 克隆子的初步筛选 当e e o l i 细胞中成功转入含有外源片段的重组质粒后 它能在含a m p 的抗 性培养基上生长 挑取单个菌落于含a m p 的液体l b 培养基中 提取质粒进行 进一步筛选 1 2 2 4 提质粒进行筛选 碱烈解法 1 用无菌牙签挑取单个菌落 再将牙签放到含a m p 的l b 液体培养基中 3 7 摇床上培养过夜 四川大学硕士学位论文 2 离心收集菌体 去尽培养液 将细菌沉淀重悬于1 0 0 u l 用冰预冷的溶液 i 中 剧烈振荡 溶液i 5 0 m m o l l 葡萄糖 2 5 m m o l lt f i s e l p h 8 0 1 1 0 m m o l l e d t a p h 8 o 3 加入2 0 0 u l 新配制的溶液i i 现用现配 快速颠倒 溶液 0 2 m o l ln a o h 1 s d s 4 加入1 5 0 u l 用冰预冷的溶液 温和振荡1 0 s 置冰上3 5 r a i n 溶液 5 m o l l 乙酸钾 6 0 m l 冰醋酸 1 1 5 m l 水2 5 5 m l 5 1 2 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n 取上清于另一离心管中 6 加等量的酚 氯仿 常温振荡均匀 1 2 0 0 0 r p m5 m i n 7 用2 倍体积的乙醇沉淀双链d n a 振荡混合 2 0 放置2 0 m i n 8 1 2 0 0 0 r p m 离心5 m i n 9 吸去上清 晾干 1 0 用l m l7 0 乙醇洗涤沉淀 按 8 的方法去掉上清 在空气中干燥 1 1 用4 0 u l 含r n a 酶的t e 重新溶解核酸 振荡 贮存于 2 0 1 2 2 5 双酶切鉴定 根据所用质粒载体提供的多克隆位点 选择限制性内切酶觑蒯仞和 以j r 进行双酶切鉴定 其反应体系如下 质粒5 u l 2 x b u f f e rl u l 日跏d 0 5 u l e c o r l 0 5 u l 2 5 四川大学顼士学位论文 d d i 1 2 03 u l 总体积为l o u l 混匀 3 7 c 酶切过夜 产物取5 u l 用1 o 琼脂糖凝胶电 泳和e b 染色检测 凡是能切出合适片段的样品 均视为阳性克隆 1 2 2 6 测序 将保存的样品送样测序 测序由i n v i t r o g e n 公司完成 1 2 2 7 数据分析一同源性分析和系统发育树的构建 利用b l a s t h t t p w w w n c b i n l m n i h g o v b l a s t 将所测定菌株0 6 0 8 0 5 的 1 6