水相中酵母细胞催化4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原反应.pdf

文章编号 0253 9837 2004 06 0434 05 研究论文 434 438 收稿日期 2003 08 29 第一作者 杨忠华 男 1976生 博士研究生 联系人 姚善泾 T el 0571 87951982 E mail yaosj che zju edu cn 基金项目 国家自然科学基金资助项目 20276065 水相中酵母细胞催化4 氯乙酰乙酸乙酯不对称还原反应 杨忠华 姚善泾 浙江大学化学工程与生物工程学系 浙江杭州310027 摘要 利用活性酵母细胞催化4 氯乙酰乙酸乙酯 COBE 的不对称还原可以直接合成具有光学活性的4 氯 3 羟基丁酸乙酯 C BE 实验发现 在水相体系中主要生成D S 型产物 COBE的转化率及C BE的收率和光学选择性都比较高 考察了 底物和产物的浓度 辅助底物的种类和浓度 体系的 p 和温度以及菌体培养条件等因素对反应的影响 结果表明 在较低 COBE浓度下R 型产物占优 在高浓度下主要是S型产物 较高的反应温度有利于S型产物的生成 p 8 0时可获得较高 的S型产物选择性 产物C BE对COBE的还原反应具有一定的抑制作用 在酵母催化COBE还原的同时需要一定的辅助 底物来再生辅酶NAD P 利用乙醇 异丙醇和仲丁醇作辅助底物可获得较高的立体选择性 对数生长期和厌氧条件培养的 细胞对生成S型产物较有利 关键词 酵母 4 氯乙酰乙酸乙酯 水相 不对称还原 手性化合物 4 氯 3 羟基丁酸乙酯 中图分类号 O 643 55文献标识码 A Asy mmetric reduction of e thyl 4 chloro 3 oxobutanoate to e thyl 4 chloro 3 Hydroxybutanoate by Yeast cells in AIueous phase YANG zhonghua YAO shanjing D ePart m ent of Che m ical and bioche m ical engineering Zhejiang Unioersity Hangzhou 3l 27 Zhejiang China Abstract The asymmetric reduction of ethyl 4 chloro 3 oxobutanoate COBE to optically active ethyl 4 chloro 3 hydroxybutanoate C BE catalyzed by yeast cellsin aCueous phase wasinvestigated The reduction was con ducted in T ris C l buffer and the concentrations of COBEand C BEand the optical purity of product were de ter m ined by capillary GCand PLCeCuipped w ith a chiralcel OBcolumn respectively The product was mainly D S C BE Both the yield and the stereo selectivity of C BE were higher for the reaction owever the product was mainlyR C BE when the initial concentration of COBE was low and the product was mainlyS C BE when the initial concentration of COBE was higher The C BE had a fewof inhibition effects on the re action In the COBEreduction a co substrate was reCuired to regenerate the NAD P Ethanol isopropanol and secondary butyl alcohol as the co substrate were advantageous to the stereo selectivity ofS C BE but glu cose as the co substrate could achieve higher yield The higher temperature and p 8 0 were favorable to the production ofS C BE The cells in logarithm ic growth phase and cultured under anaerobic condition were also favorable to the stereo selectivity ofS C BE 92 for yield and 90 for ee ofS C BE were obtained respec tively under appropriate reaction conditions Key words yeast ethyl 4 chloro 3 oxobutanoate aCueous phase asymmetric reduction chiral compound ethyl 4 chloro 3 hydroxybutanoate 光学活性化合物的合成在有机合成中是一个非 常重要的研究领域 1 生物催化因其温和的反应条 件和较高的立体选择性在不对称合成中具有很大的 优势 微生物细胞中含有许多具有立体选择性的 第25卷 第6期催化学报 2004 年6月 Vol 25 No 6Chinese Journal of CatalysisJune 2004 酶 因此常被用于催化不对称合成 2 使用活性细 胞催化不对称合成 不但可以省去繁杂的酶分离和 纯化步骤 而且微生物细胞中还含有一些在胞内具 有催化活力而在胞外极容易失活的酶有利于生物催 化的进行 同时 具有生物活性的细胞在催化过程 中只需添加廉价的能源物质就能再生催化不对称还 原所必需的且价格昂贵的辅酶 3 有利于生物催化 的产业化 面包酵母还原 羰基酯可生成具有光学活性 的 羟基酯 这类化合物是许多药物 如 内酰胺 类药物等手性药物 的手性中间体 光学活性的L R 和D S 4 氯 3 羟基丁酸乙酯 CHBE 由于 引入了一个活泼的氯原子在不对称合成中非常有 用 是许多手性药物的重要手性中间体 如 R CHBE是合成 大内酰亚胺A 4 L 肉碱 5 和R 氨基 羟基丁酸 6 的关键手性中间体 同时还可 转化为 负霉素 7 另一方面 S CHBE 是合成 S lagenins B和C 8 以及HMG CoA还原酶抑制剂 9 的关键手性中间体 还可以转化为1 4 二氢吡啶型 阻断剂 10 有关面包酵母催化 羰基酯不对称还原反应 的研究已有许多报道 但这类研究主要集中在酵母 容易催化且光学选择性较高的乙酰乙酸乙酯的还原 上 11 12 有关催化4 氯乙酰乙酸乙酯 COBE 不对 称还原反应的研究虽有所报道 13 但并不详细 我 们课题组曾对有机相中利用面包酵母催化COBE 的不对称还原反应进行过一些研究 得到的产物主 要是L R 型 并发现在有机相中利用细胞催化不 对称合成存在一定程度的细胞失活 14 本文对酵 母在水相体系中催化COBE不对称还原生成光学 活性的CHBE的反应进行了研究 1 实验部分 1 1 材料和试剂 面包干酵母 由广东梅山酵母有限公司生产 COBE S CHBE 和R CHBE均 为 分 析 纯 购 自 A cros 公司 正癸烷为分析纯 购自S igma公司 乙 酸乙酯等其他化学试剂均为分析纯 购自中国医药 集团 上海化学试剂公司 盐酸和葡萄糖为市售分 析纯试剂 T ris和酵母浸膏为B io Basci inc产品 1 2 面包干酵母的活化及酵母培养 在200 m l活化液 含葡萄糖5 NH4 2SO4 0 2 K2HPO40 1 CaSO40 1 柠檬酸0 1 中 加入7 5 g面包干酵母粉 在摇床 175 r m in 30 C 中恒温活化1 h 在500 m l锥形瓶中装入121 C下灭菌30 m in 的培养基100 m l 培养基组成为酵母浸膏5 0 g KH2PO42 7 g NH4 2SO43 8 g M gSO40 18 g 葡 萄糖50 g 去离子水1 L 在无菌条件下加入0 05 g 面包酵母粉 然后在好氧 锥形瓶口只封纱布 限氧 锥形瓶口除纱布外再加1 0 cm厚的棉花 及 厌氧 锥形瓶口以橡胶塞密封 条件下 在摇床 175 r m in 30 C 中恒温培养48 h 1 3 C O B E不对称还原反应 活化或培养的菌体通过离心 6 000 r m in 10 m in 收集 离心后的菌体再以T ris HC l缓冲液 50 mmol L pH 7 0 洗涤两次 得到的菌体在4 C下 保存备用 取4 0 g湿菌体 菌体干湿比为0 25 悬浮于50 m l的T ris HC l缓冲液中 再加入340 l 的COBE 约50 mmol L 和0 5 g葡萄糖或其他辅 助底物 在摇床 175 r m in 30 C 中恒温反应2 h 1 4 产物的分离与分析 反应一定时间后 取混合液25 m l 用乙酸乙酯 萃取0 5 h 离心分离 上清液以无水Na2SO4干燥 后用气相色谱分析产物和未反应底物的浓度 以正 癸烷为内标物定量 色谱仪 安捷伦科技1790型 装有以KF 1为固定相的毛细管柱 0 25 mm 0 3 m I30 m FiD检测器 色谱条件 色谱柱 初温90 C维持4 m in 升温速率20 C m in 终温 180 C维持3 m in 气化和检测温度均为250 C 载 气为N2 柱前压0 1 MPa 进样量0 3 l 分流比 100I 1 利用W ZZ 2S型数字式自动旋光仪测定萃 取产物的旋光值 旋光管长20 cm 同时取5 m l反 应混合液以正己烷萃取 上清液经0 22 m 的微滤 膜过滤后用装有手性柱Chiralcel OB的高效液相色 谱仪测定产物中S和R对映异构体的含量 液相 色谱条件 以正己烷 异丙醇 体积比9I 1 为流动 相 流率为0 8 m l m in 色谱操作温度为25 C 紫 外217 nm下检测 进样量为20 l 反应的光学选 择性以产物的对映体过量值 ee 表示 ee OS OR OS OR 式中O S和OR 分别为S CHBE和R CHBE的浓度 2 结果与讨论 2 1 酵母催化C O B E不对称还原反应性能 酵母中含有多种氧化还原酶 如D 和L 羟基 534 第6期杨忠华 等 水相中酵母细胞催化4 氯乙酰乙酸乙酯不对称还原反应 酯还原酶及脂肪酸合成酶等 可催化 羰基酯中 羰基的不对称还原 生成相应的具有光学活性的 羟基酯 15 但是 这些酶催化还原反应需有作为电 子传递的辅酶NAD P 参与 而细胞中NAD P 的量很少 仅约为100 g g 16 因此 在这类反 应中必须再生辅酶NAD P 才能使反应顺利持续 进行 活性细胞可利用葡萄糖或其他碳源在代谢过 程中产生辅酶 使这两种反应在细胞内进行耦合 我们主要使用葡萄糖作辅助底物以再生辅酶 同时 还考察了其他碳源作辅助底物的影响 分析结果表明 反应后的产物为C BE 且以 型为主 在我们先前的实验中 以邻苯二甲酸二丁 酯作反应介质 得到的产物主要是 C BE 对映 体过量值约为70 14 因此 反应介质对酵母催化 羰基不对称还原立体选择性的影响很大 Nakamura 等 17 以苯为介质也发现同样的现象 这可能是由 于有机介质抑制催化 构型产物酶的活性所致 图1为COBE还原反应的进程曲线 可以看 出 酵母对COBE还原的催化活性较高 反应速率 较快 通过反应进程曲线的求导可得到初始反应速 率为2 7 mmol g h 2 h 时反应进行完全 但是 反应结束后产物的浓度小于底物的初始浓度 说明 在反应过程中有副反应发生 图1 COBE还原反应的进程曲线 F ig 1Reduction of ethyl 4 chloro 3 oxobutanoate COBE to ethyl 4 chloro 3 hydroxybutanoate C BE catalyzed by yeast cells 1 COBE 2 C BE Reaction conditions 0 COBE 50 mmol L p 7 5 30 C 2 2 底物和产物浓度对COBE不对称还原反应的 影响 不同底物的浓度对酵母催化COBE不对称还 原有一定的影响 由表1可以看出 当 0 COBE 50 mmol L时 COBE浓度对反应转化率和收率的影 响不大 当 0 COBE 50 mmol L时 随着底物浓 度的增大 反应的转化率和收率显著下降 这可能 主要是由于底物对反应的抑制作用所致 还可以看 出 0 COBE 14 8 mmol L 时 产物以 C BE 为主 ee 0 随着底物浓度的增大 C BE越来 越过量 这是由于在酵母中含有催化 羰基酯分别 生成D型和L型产物的酶 而这两类酶具有不同的 m和 cat值 15 当底物浓度不同时 催化生成D型 和L型产物的速率不同 因而ee值也不相同 表1底物初始浓度对酵母细胞催化COBE不对称还原的影响 T able 1Effect of substrate concentration on reduction of COBEcatalyzed by yeast cells 0 COBE mmol L COBE C BE ee 14 899 177 0 12 1 25 098 487 351 4 50 099 986 584 9 75 085 563 188 3 100 062 031 687 8 Reaction conditions p 7 5 30 C 2 h eeEnantiomeric excess defined as Where C BE and C BE 为了考察产物C BE对反应的影响 在反应体 系中加入不同量的C BE 反应结果如表2所列 可以看出 产物对COBE不对称还原反应具有较大 的抑制作用 表2产物初始浓度对酵母细胞催化COBE不对称还原的影响 T able 2Effect of product concentration on reduction of COBEcatalyzed by yeast cells 0 C BE mmol L COBE C BE ee 7 199 975 567 3 14 397 970 957 0 28 687 962 141 7 42 879 851 329 9 71 460 531 014 3 Reaction conditions 0 COBE 50 mmol L p 7 5 30 C 2 h 2 3 pH 值对COBE不对称还原反应的影响 用不同 p 的T ris C l缓冲液体系考察了 p 值对酵母催化COBE不对称还原的影响 结果如图 2 所示 可以看出 p 值对反应转化率的影响不 大 但对收率有较大的影响 在碱性反应体系中收 率明显降低 这是由于COBE和C BE在水中不稳 634 催化学报第25卷 图2 PH 值对酵母细胞催化COBE不对称还原的影响 F ig 2Effect of p value on reduction of COBE catalyZed by yeast cells 1 X COBE 2 Y C BE 3 ee Reaction conditions c 0 COBE 50 mmol L 30 C t 2 h 定 易水解所致 还可以看出 当p 8 0时 产物 的立体选择性ee值最大 何成等 12 在考察非水相 体系中酵母细胞催化乙酰乙酸乙酯不对称还原时发 现 当p 7 0时产物的立体选择性较高 这种差 异可能是由于反应底物不同和反应介质不同所致 2 4 反应温度对COBE不对称还原反应的影响 测定了不同温度对酵母催化COBE不对称还 原的影响 结果如表3所列 可以看出 温度对反应 转化率的影响不很大 但是 温度较高时C BE的 收率有所下降 这与较高的温度加快了副反应有 关 还可以看出 随着温度的升高 产物的立体选择 性急剧增大 说明较高的反应温度有利于提高催化 D产物酶的活性 15 表3反应温度对酵母细胞催化COBE不对称还原的影响 T able 3Effect of reaction temperature on reduction of COBEcatalyZed by yeast cells CX COBE Y C BE ee 2595 991 650 1 3097 585 468 9 3598 188 786 7 4099 983 184 4 Reaction conditions c0 COBE 50 mmol L p 7 5 t 2 h 2 5 辅助底物对COBE不对称还原反应的影响 细胞中的氧化还原酶催化COBE还原时要不 断消耗作为电子供体的还原型辅酶NAD P 活 性细胞为了保持正常的生理氧化还原状态 需要不 断再生还原型辅酶 以保持胞内正常的氧化还原平 衡 我们考察了葡萄糖浓度对酵母细胞催化COBE 不对称还原的影响 结果如表4所列 可以看出 不 加辅助底物时虽然也能转化一定量的COBE 但 C BE收率很低 随着葡萄糖浓度的增大 COBE转 化率和C BE收率均急剧升高 说明辅酶再生起到 作用 但是 当葡萄糖浓度高于10 g L时 COBE转 化率和C BE收率均趋于平衡值 还可以看出 葡 萄糖浓度对反应的立体选择性没有太大的影响 表4葡萄糖浓度对酵母细胞催化COBE不对称还原的影响 T able 4Effect of glucose concentration on reduction of COBEcatalyZed by yeast cells glucose g L X COBE Y C BE ee 073 052 086 0 595 074 285 0 10100 085 886 8 5099 985 185 0 Reaction conditions c0 COBE 50 mmol L p 7 5 30 C t 2 h 还考察了乙醇 异丙醇 甘油和仲丁醇等辅助底 物对反应的影响 结果如表5所列 可以看出 不同 的辅助底物对COBE转化率的影响不大 但对 C BE收率的影响较大 其中葡萄糖的结果最好 对于立体选择性 以乙醇 异丙醇和仲丁醇作为辅助 底物可获得较高的ee值 表5不同辅助底物对酵母细胞催化COBE不对称还原的影响 T able 5Effect of different co substrates on reduction of COBEcatalyZed by yeast cells Co substrate g L X COBE Y C BE ee G lucose10100 085 480 2 Et O 1092 864 090 8 G lycerol1090 475 486 0 i PrO 1095 460 989 3 s e c BuO 1092 159 689 5 Reaction conditions c0 COBE 50 mmol L p 7 5 30 C t 2 h 2 6 菌体培养条件对COBE不对称还原反应的影 响 不同生长条件下培养的酵母含有不同的酶系 对催化COBE不对称还原具有一定的影响 考察了 好氧 限氧和厌氧条件下培养稳定期的酵母及好氧 条件下培养对数生长期的酵母的催化性能 结果如 表6所列 可以看出 对于好氧条件下培养的不论 是稳定期还是对数生长期的酵母 其催化性能都较 好 但后者催化反应的C BE收率和立体选择性更 734 第6期杨忠华 等 水相中酵母细胞催化4 氯乙酰乙酸乙酯不对称还原反应 高些 在厌氧条件下培养的菌体的催化反应的立体 选择性最高 对于限氧条件下培养的细胞 其催化 反应的C BE收率和立体选择性都较高 这与Dahl 等 11 的实验结果相一致 表6菌体培养条件对酵母细胞催化COBE不对称还原的影响 T able 6Effect of culture conditions on reduction of COBEcatalyZed by yeast cells Condition X COBE Y C BE ee A erobic stat phase100 092 780 7 S i m aerobic stat phase100 086 988 6 Anaerobic stat phase74 768 590 5 A erobic log phase99 997 983 7 Reaction conditions c0 COBE 50 mmol L p 7 5 30 C t 2 h 3 结语 以上实验结果表明 面包酵母能催化含有氯原 子的 羰基酯的不对称还原反应 在水相体系中生 成以D S 型产物为主的 羟基酯 这与在有机介 质中使用该微生物催化COBE的立体选择性相反 虽然反应获得了较高的立体选择性 ee值可高达 85 89 但通过对酵母的热处理和添加一些酶 抑制剂也许还可进一步提高反应的立体选择性 这 有待进行更深入的研究 在水相体系中 利用微生物催化含有羰基的酯 类物质的还原存在一定的副反应 尤其是在碱性条 件下副反应更加明显 这主要是由于COBE会发生 少量的水解 同时 酵母细胞中含有少量的能催化 酯水解的酯酶和脂肪酶 会使扩散进酵母细胞中的 COBE或C BE发生少量的分解副反应 可通过其 他的方法 如通过多次加反应底物 使用吸附树脂吸 附反应底物和产物以及使用水 有机两相反应体系 来减少副反应的发生 综上所述 将直接从市场上购买的廉价的面包 酵母 经过简单的处理就可用于COBE的不对称催 化还原 且反应的收率和立体选择性都较高 其光 学活性的产物将在手性药物的合成中具有很重要的 地位 同时 COBE在水相中具有较高的溶解度 因 此 这类反应具有较高的工业应用价值 参考文献 1Rouhi A M che m eng New s 2003 8l 18 45 2Servi S Synthesis 1990 1 2 1 3Yang F Russell AJ biotechnol progr 1993 9 3 234 4M arino J P M cC lure M S olub D P Comasseto J V Tucci F C J Am che m Soc 2002 l24 8 1664 5Song C E Lee J K Lee S Lee S G T etrahedron A symm etry 1995 6 5 1063 6Kolb C Bennani Y L Sharpless K B T etrahedron A symm etry 1993 4 1 133 7Davies S G Ichihara O T etrahedron A symm etry 1996 7 7 1919 8Jiang B L iu J F Zhao S Y O rg Lett 2001 3 25 4011 9KaraneW sky D S Badia M C C iosek C P Jr Robl J A Sofia M J S i mpkins L M DeLange B arrity T W B iller S A Gordon E M J m ed che m 1990 33 11 2952 10K ita K Kataoka M Shi m iZu S J biosci bioeng 1999 88 6 591 11Dahl A C M adsen J T etrahedron A symm etry 1998 9 24 4395 12 何成 许建和 刘幽燕 庄英萍 化学研究与应用 e Ch Xu J L iu Y Y Zhuang Y P che m Res APPl 2001 l3 6 632 13Zhou B N Gopalan A S Van M iddlesWorth F Shien W R S ih CJ J Am che m Soc 1983 lo5 18 5925 14 蒋群 博士学位论文 杭州 浙江大学 Jiang PhD D issertation angZhou Zhejiang Univ 2002 15Nakamura K KaWai Y Nakaji ma N Ohno A J O rg che m 1991 56 15 4778 16W indholZ M Buhavari S B lumetti R Fet al The M erck Index 10th Ed RahWay M erck Badia M C Ciosek C P Jr Robl J A Sofia M J Simpkins L M DeLange B Harrity T W Biller S A Gordon E M 查看详情 外文期刊 1990 11 3 Jiang B Liu J F Zhao S Y 查看详情 2001 25 4 Davies S G Ichihara O 查看详情 外文期刊 1996 07 5 Kolb H C Bennani Y L Sharpless K B 查看详情 外文期刊 1993 01 6 Song C E Lee J K Lee S H Lee S G 查看详情 外文期刊 1995 05 7 Marino J P McClure M S Holub D P Comasseto J V Tucci F C Stereocontrolled synthesis of macrolactin A 外文期刊 2002 08 8 Yang F Russell A J 查看详情 外文期刊 1993 03 9 Servi S 查看详情 1990 1 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