TS与5-fu治疗的关系.doc

国外学者发现胸苷酸合成酶 (TS)是 5-FU产生耐药的一个重要酶，癌组织中 TS的表达水平可以用于指导治疗并与患者的预后相关，TS高表达患者对 5-FU的敏感性明显高于低表达者，TS低表达容易对 5-FU产生耐药性。胸苷磷酸化酶(Thymidine phosphorylase，TP)、胸苷酸合成酶(Thymidylate synthase，TS) 和二氢嘧啶脱氢酶(dihydropyrimidine dehydrogenase，DPD)是细胞核酸代谢过程中起重要作用的三个酶，并且以不同的角度与5-FU相互作用而影响5-FU的疗效。TP可逆性地催化胸腺嘧啶核苷转变为2-脱氧核糖-1-磷酸和胸腺嘧啶，即通过催化胸苷和胸腺嘧啶的相互转化而稳定细胞内胸苷的水平。进入体内的5-FU需经过TP的作用被活化后才具有抗癌作用，TP还具有血管生成活性，与PD-ECGF是同一基因的转录产物。TS是合成胸苷酸的限速酶，催化dUMP转化为dTMP，而dTMP是DNA合成和修复所必须的胸腺嘧啶核苷酸的唯一来源，所以TS在细胞增生过程中发挥重要作用。TS也被证明是5-FU作用的靶向酶，5-FU就是通过抑制TS活性阻断DNA合成而发挥抗肿瘤的作用。DPD是尿嘧啶和胸腺嘧啶分解过程中的第一限速酶，可降低用于DNA合成的尿嘧啶和胸腺嘧啶的水平而影响DNA的合成。DPD同时也是降解5-Fu的最主要的限速酶，体内5一FU用量的85%由此酶降解。.胸苷酸合成酶对结肠癌5Fu化疗耐药影响的前瞻性研究【摘要】 目的 探讨结肠癌对5Fu产生耐药的机理,从细胞培养水平上进一步论证胸苷酸合成酶对5Fu化疗产生耐药的影响。方法 应用MTT法对体外培养的30例结肠癌细胞进行5Fu药敏试验，再应用SP免疫组化法对30例结肠癌进行胸苷酸合成酶检测，然后将两个结果进行比较。结果 胸苷酸合成酶高表达组体外培养的结肠癌细胞对5Fu的敏感性明显低于TS低表达组。结论 胸苷酸合成酶表达程度的高低对临床结肠癌患者化疗药物的选择有一定的指导意义。 【关键词】 结肠癌;MTT;免疫组织化学;胸苷酸合成酶（TS）;5Fu;细胞培养The Influence of Thymidylate Synthase (TS) in Colon Carcinoma used 5Fu Cure Prospective StudyCHEN Xin, LIN Wenbo, SHEN YouzhuDepartment of Pathology,Fujian Provincial Hospital,Fuzhou 350001,China;Nanan Hospital of Fujian Province；1st Hospital of Zhaoan cityAbstract：Objective To investigate the reason of the 5Fu drug resistance, and to prove deeply the influence of TS in colon carcinoma with the level of cell culture.Methods To proceed the 5Fu drug susceptibility test with MTT method to 30 cases in vitro culture colon carcinoma cell; to be examined by SP immunohistochemical staining and observed the expression of TS; and then compare with them.Results In vitro culture colon carcinoma cells corresponding highexpression of TS the senility to 5Fu delay obviously than the lowexpression.Conclusion The positive expression of TS has a instruction significance in colon carcinoma patients at the election of chemistry drug.Key words：Colon carcinoma;MTT；Immunohistochemical;Thymidylate synthase (TS); 5Fu; Cellculture0 引言 5Fu广泛应用于肠道恶性肿瘤的化学治疗，由于它疗效确切一直处于其他化疗药无法替代的地位，目前仍是肠道恶性肿瘤的首选化疗药。但一些结肠癌病例对5Fu为主的化疗并不敏感，为提高对5Fu原发性和继发性耐药患者的治疗效果，有必要从细胞水平上阐明5Fu耐药机制，找出能用于评价5Fu化疗敏感性的指标。1 材料与方法1.1 材料 选取我院术前未进行5Fu化疗的结肠癌新鲜标本30例，其中男性21例，女性9例，再将所有结肠癌根治术标本经10福尔马林液固定，石蜡包埋。1.2 试剂 RPMI1640培养基干粉，胎牛血清,MTT，透明质酸酶胰蛋白酶，型胶元蛋白酶，DNA酶，220nm薄膜滤菌器，以上试剂均来自华美生物工程公司北京分公司。 绵羊抗人TS蛋白单克隆抗体，AP标记的兔抗绵羊二抗（美国Rockland公司），生物素代兔抗绵羊二抗（美国K.P.L公司）。SP试剂盒，DAB显色试剂盒（福州迈新公司）。1.3 方法1.3.1 肿瘤细胞培养 无菌条件下取手术根治切除的结肠癌组织，置于合有500U/ml青霉素，500gml链霉素清洗（10min）,将肿瘤组织剪成1mm3碎块后，置于含有型胶元蛋白酶（200U/g）型DNA酶（100U/g），型透明质酸酶（1 500U/g）的RPMI1640培养基（4，20h）,离心（1 000r/min，5min）两次，收集单个细胞用RPMI1640液将细胞洗两遍后，以5105个ml活细胞数接种于培养瓶中，加入20胎牛血清（FBS），置于CO2培养箱中（37，5CO2），次日培养细胞贴壁，3天更换一次生长液，计算肿瘤细胞群体增倍时间（36h），不用传代，直接用原代细胞进行实验。将细胞悬液浓度为2104ml加入96孔培养板中，每孔200l，置于二氧化碳培养箱中（37，5CO2，2h）；在96孔板中加入5Fu（150gml），每孔20l，置于二氧化碳培养箱中（37，5CO2，36h）；吸弃上清每孔加入MTT应用液（5mg/ml）20l，培养4h后，每孔再加200l的酸化异丙醇终止反应，以上步骤均严格遵循无菌操作原则，最后用酶标仪测定每孔及光度值（测定波长540nm），以未加5Fu进行药敏的癌细胞为对照组。1.3.2 免疫组化染色 采用SP法进行免疫组化染色；将30例结肠癌石蜡切片脱蜡至水，无须抗原修复，直接浸入3H2O2内源性酶处理10min，PBS洗35min；10正常羊血清封闭10min，PBS洗35min；加一抗（绵羊抗人TS蛋白单克隆抗体1300稀释）1h，PBS洗35min；加生物素标记的二抗（兔抗绵羊1400稀释）10min，PBS洗35min；加SP溶液，10min，PBS洗35min； DAB显色，苏木素复蓝，中性树胶封片。1.3.3 结果判断 TS蛋白表达阳性区域在细胞浆中出现棕黄色的阳性颗粒。随机选取4个中倍视野（1010），计算400个细胞浆中阳性细胞的百分数，当阳性细胞数目75为（+）。计算每例结肠癌细胞体外培养的5Fu药敏试验的抑制率（）：抑制率（）=（1-试验孔OD540对照孔OD540）1002 结果 30例结肠癌组织TS蛋白表达均为阳性，根据肿瘤细胞阳性数分为两组：高表达组（+），低表达组（+），见表1。表1 TS蛋白高表达组与低表达组比较（略）表2 TS表达与体外培养的癌细胞5Fu抑制率的关系（略）从表2可以看出TS高表达组的体外培养癌细胞5Fu抑制率明显低于低表达组，差别具有统计上的意义（P0.05）。3 讨论 5Fu广泛应用于肠道恶性肿瘤的化学治疗，由于它疗效确切，一直处于其他化疗药无法替代的地位，但一些结肠癌病例对5Fu为主的化疗并不敏感，其对5Fu单药治疗的有效率仅203，本文想通过体外细胞培养，从活细胞水平上论证胸苷酸合成酶对结肠癌5Fu化疗耐药的影响。 MTT法的原理是以黄色的四氮唑盐可被活细胞线粒体中的与辅酶NADP相关的脱氢酶过厚，即接受氢原子而成为不溶性的甲铒替颗粒，而死细胞无此功能，无甲铒替颗粒形成，因此用酶标仪测定的OD540值越高，说明肿瘤细胞的耐药性越强，药物抑制率越低。 胸苷酸合成酶（TS）是由两个相同亚单位组成的聚体蛋白质，每个亚单位的分子量为36Kda，Hori等研究发现TS基定位于为类第18号染色体上1。TS的功能是催化尿嘧啶脱氧核苷（dUMP）甲基化为胸腺嘧啶脱氧核苷（dTMP），这是dTMP从头合成途经中关键的步骤，而dTMP又是DNA的生物合成所必需的，因此，通过对TS进行抑制就能达到抑制DNA的生物合成,进而抑制细胞生长或增殖的作用。5Fu正是通过对TS进行抑制而发挥其抗癌活性的。5Fu进入体内后经过一系列酶促反应，最后转变为其活性代谢产物5氟尿嘧啶脱氧核苷（5FudUMP），它在辅因子5,10亚甲基四氢叶酸存在下，能与TS结合形成等价的三联复合物TSFdUMPCH2FH4，影响dUMP与TS的结合，从而抑制了dTMP的合成，使DNA的合成受限，导致细胞生长受到抑制甚至死亡1。 许多学者研究表明，癌组织中TS的表达水平与患者的预后呈负相关，TS的表达可以作为判断癌症患者预后的指标2, 47，Tachikawa和Takenoue等对肠癌患者的研究结果显示TS低表达组对5Fu的敏感性优于高表达组，其预后也明显优于TS高表达组8,9。Copur等10对人类H630肠癌细胞株与其继发5Fu耐药株H630R1,H630R10,H630R等进行比较，结果显示随着细胞株耐药性的增加，细胞中的TS水平也明显增加，这也从另一方面说明了TS对细胞耐药性的影响。 本研究课题从活细胞水平上对胸苷酸合成酶对结肠癌5Fu化疗耐药的影响进行了更进一步的探讨，结果显示结肠癌TS高表达组的体外培养的癌细胞对5Fu化疗药物的敏感性明显低于TS低表达组的体外培养的癌细胞，这种差别具有统计学上的意义（P0.05），这说明TS高表达组的患者对5Fu化疗的敏感性可能明显低于TS低表达组，因此容易产生耐药，与文献报道是相符的，进一步论证了胸苷酸合成酶的表达程度对临床结肠癌患者在化疗药物上的选择有一定的指导意义。【参考文献】 1 Hori T,Takahashi E,Ayuasawa D,et al.Regional assignment of human thymidylate synthase(TS) gene to chromosome band 18p11.32 by nonisotopic in situ hybridizationJ.Hum Genet, 1990,85(3):576580.2 Lenz H.J,Leichman C G,Danenberg K D,et al.Tymidylate synthase mRNA level in adenocarcinoma of the stomach:a predictor for primary tumor response and overall survivalJ.J Clin Oncol, 1996, 14(1):176182.3 Mader RM, Resistance to 5fluorouracilJ.Gen Pharmacil, 1998,31(5):661665.4 Yeh KH,ShunC T ,Chen C L,et al.High expression of thymidylate synthase is associated with the drug resistance of gastric carcinoma to high dose 5fluorouracilbased systemic chemotherapyJ.Cancer,1998, 82(9):16261631.5 Johnston P G,LenzH J,Leichman C G et al.Thymidylate synthase gene and protein expression correlate and are associated with response to 5fluorouracil in human colorectal and gastric tumorsJ.Cancer Res, 1995, 55(7):14071412.6 Daries M M,Johnston P G,KaurS.,et al.Colorectal liver metastasis thymidylate synthase staining correlates with response to hepatic arterial floxuridineJ.Clin Cancer Res, 1999,5(2):325328.7 Leichman C.G.Thymidylate synthase as a predictor of responseJ.OncologyHuntingt,1998,12(4):4347.8 Tachikawa D,Arimas and Futami K.Immunohistochemical exPression of thymidylate synthase as a Prongostic factor and as a chemothera Peutic index in Patiemts with colorectal carcinomaJ.Anticancer Res, 2000,20(5):41034107.9 Takenou T,Nagawa H,Matsuda K, et al. Relaton between thymidylate synthase expression and surriral in colon carcinama,and determination of appropriate application of 5fluouracil by immuneohistochemical methodJ.Ann Surg Oncol,2000,7(3):193198.10CopurS, Aibak,Drake JC,et al.Thymidylate synthase gene aumplification in hnman colon cancor cell lines resitant to 5fluorouracilJ.Biochem Pharmacol，1995,17;49(10):14191426.编辑：李奇明；校对： 刘红武氟脲嘧啶药物敏感性与基因多态性研究进展关键词 氟尿嘧啶；化学治疗；单核苷酸多态性；疗效；毒性 中图分类号 R979.1文献标识码 A文章编号 1671-7562（2007）02-0138-04 基因表达谱的显著差异是指导肿瘤个体化治疗的基础，已有多种抗肿瘤药物通过检测相关分子及其基因多态性来预测患者对相应药物的敏感性和毒性。氟脲嘧啶(5-FU)是最常用的化疗药物，与其它药物组成了多种有效的化疗方案。胸苷酸合成酶（TS)、二氢吡啶酶（DPD）、乳清酸磷酸核糖基转移酶（OPRT）等分别作为5-FU合成代谢和分解代谢的关键酶，在5-FU的作用途径中起着重要的作用，其基因的多态性与5-FU的疗效和毒性密切相关。 1 TS TS是由两个相同亚基组成的二聚体,作用于细胞周期G1至S期,是嘧啶核苷酸合成的限速酶,也是5-FU发挥细胞毒作用的目标酶。肿瘤细胞对5-FU敏感性与TS基因（TS mRNA）相关，Fukushima等1用5-FU处理人结肠癌KM12C细胞后得到对5-FU不敏感细胞（5-FU的抑制率为7.9%），其TS活性比未处理细胞（5-FU的抑制率为81.8%）高23倍，TS mRNA水平的增加与TS活性的增加是一致的。Amatori等2用5-FU处理Colo 320、HT-29、CaCo-2和SW620这4种肿瘤细胞，并通过检测肿瘤细胞对5-FU的敏感程度，观察其与TS mRNA的关系。结果显示，在对5-FU最为敏感的CaCo-2中TS mRNA表达水平较低，而在对5-FU敏感性较低的SW620中TS mRNA高表达。 Lenz等3早年通过荧光定量PCR检测65例接受5-FU和铂类药物化疗胃癌患者的胃镜活检肿瘤组织TS mRNA水平，发现TS mRNA水平高者中位生存期为6个月，而TS mRNA水平低者为43个月。Edler等4用免疫组化法检测862例大肠癌患者（单独手术治疗/手术加5-FU辅助化疗）肿瘤组织中的TS蛋白水平，发现在单独手术组中低TS水平者生存期更长(P=0.04)。Ciaparrone等5通过免疫组化方法检测62例接受过含5-FU术后辅助化疗的结直肠癌患者肿瘤组织中的TS蛋白水平，结果发现，TS蛋白水平是转移性结直肠癌患者无病生存时间（DFS）及总生存时间（OS）的独立预后因素。TS蛋白表达水平低者，其DFS及OS优于TS蛋白表达高者。一项包含13项研究共887例进展期结直肠癌的Meta分析显示，高TS蛋白表达者预后不佳6。 在TS基因启动子区（TSER)，即5端末翻译区(5-UTR)存在28bp的重复片段多态性,与TS基因表达水平、5-FU化疗敏感性及毒性反应、远期生存率存在相关性。TSER的2和3倍重复片断最常见，Marcuello等7通过对89例转移性结直肠癌患者的研究，把TS基因型分为高表达组（2R/3G、3C/3G、3G/3G）和低表达组（2R/2R、2R/3C、3C/3C），结果发现，接受基于5-FU化疗后TS基因型低表达组的中位生存时间为50个月，高表达组仅为20个月（P0.05），提示TS基因型可以作为转移性结直肠癌患者生存的独立预后因素。Matsui等8对161例接受过5-FU辅助化疗的结肠癌患者进行了前瞻性分析，寻找TS基因多态性与化疗疗效之间的关系。结果发现11例患者（6.8%）TS基因型为2R/2R型，40例（24.8%）为2R/3R型，110例（68.3%）为3R/3R型。2R/2R型的所有患者在研究结束时仍存活，但与其他两种基因型相比却无统计学意义。据此推测，TS基因型为2R/2R的患者可以从基于5-FU辅助化疗中受益。 2 DPD DPD是5-FU代谢的限速酶,体内5-FU剂量的85%都是通过DPD代谢失活，DPD活性丧失将导致严重的5-FU相关毒性反应。 Kuilenburg等9研究发现接受含5-FU化疗的患者中DPD活性高低是影响5-FU毒性的重要因素之一。DPD基因（DPYD）到现在为止至少有20种突变与DPD活性降低和5-FU毒性反应有关。此后Kuilenburg10的深入研究表明,剪切位点突变IVS14+1GA,即14内含子5剪切位点处GT突变为AT,导致DPD失活。这是最常见的导致5-FU严重毒性反应的基因突变。在该项研究中DPD活性下降的患者中28%为IVS14+1GA突变,而正常者只有4%的突变率,证明IVS14+1GA突变携带者具有发生DPD严重毒性反应的高风险。此外，DPYD等位基因突变的杂合子发生严重毒副反应的几率比纯和子高,但纯合子发生的毒副反应往往是致死性的11。肿瘤细胞内DPD水平也是影响5-FU化疗疗效的重要因素,肿瘤细胞DPD活性和DPDmRNA表达水平与肿瘤的敏感性之间存在高度的相关性。Sato等12选取了8株肿瘤细胞，其中胆管癌细胞株通过基因修饰使DPD mRNA低表达，结果显示DPD mRNA与DPD活性存在明显相关性，且发现DPD活性低的胆管癌细胞对5-FU敏感性较高。Hasegawa等13也在对接受含5-FU化疗方案的晚期结直肠癌患者长期生存时间与DPD活性的研究中发现，DPD活性低的患者能够从含5-FU化疗中得到生存受益。 与5-FU共同组成联合化疗方案的化疗药物是否会影响DPD而导致5-FU毒性反应的改变，值得深入探讨。有学者应用5-FU与铂类、喜树碱类、紫杉类、丝裂霉素等联合干预结肠癌细胞，比较细胞中DPD mRNA表达情况，结果发现，所有化疗药物在与5-FU合用后均使得细胞中DPD mRNA的表达减少，具体机制尚不明14。 3 OPRT 体内和体外实验研究显示OPRT是5-FU磷酸化的关键酶。在组织细胞内，5-FU被磷酸化后才能变成有活性的代谢物，进而通过抑制细胞DNA的合成和诱导RNA的功能障碍发挥作用。Mizutani等15在膀胱癌患者中发现OPRT高表达的患者比低表达者对5-FU有更高的敏感性，更易从5-FU的治疗中获益，这一结果提示OPRT表达水平是预测5-FU敏感性的一个因子。在接受含5-FU术后辅助化疗的胃癌患者中同样发现OPRT表达水平与5-FU敏感性密切相关16。OPRT存在多种基因多态性，如638GC、1050TA、1336AG等，但是研究发现OPRT多态性并未对5-FU敏感性产生影响17。 4 嘧啶磷酸化酶（TP) TP是5-FU前体药物卡培他宾(capecitabine)在体内转化为具有抗癌活性物质的关键酶,且与肿瘤细胞高复制、侵袭转移和肿瘤血管生成有关,并拮抗肿瘤药物的凋亡作用。 Xiao等18对70例结肠癌患者研究表明，TP阳性者比阴性者的5年生存率明显降低（33.33% vs 73.33%，P0.000 1）。但是,Yasuno等19对97例进展期结肠癌患者研究表明，肿瘤细胞TP阳性率为38%，间质细胞为49%，肿瘤细胞TP表达率与血管密度有关(P=0.051)，而间质细胞TP高表达者预后较好(P=0.012 7)。Meropol等20利用免疫组化技术对转移性结直肠癌中肿瘤原发灶和转移灶中TP的表达水平与化疗敏感性及生存期之间的关系进行了研究，结果显示原发灶中TP的表达水平与化疗敏感性及生存期均有明显相关性，高TP表达提示更好的预后。 以上资料提示TP可能是结肠癌的重要预后因子,依据TP的表达水平可以预测转移性大肠癌化疗敏感性。 5 亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR) MTHFR不可逆地催化5，10-亚甲基四氢叶酸(5，10-MTHF)，使其转变为5-甲基四氢叶酸，从而削弱了5-FU的抗肿瘤作用。MTHFR基因的多态性预测癌细胞对5-FU的敏感性可能具有较高的临床价值。 MTHFR基因多态性最常见的是第667位的密码子发生了由CT以及第1298位密码子发生了由AC的变异。Jakobsen等21在对139例接受含5-FU化疗的晚期结直肠癌患者的研究中发现，MTHFR基因第667位密码子为TT基因型者对化疗有较高敏感性。而Etienne等22采用5-FU干预 19种人类肿瘤细胞，发现第1298位密码子突变型的C/C、A/C对5-FU药物的敏感性较高，而野生型A/A对5-FU药物敏感性明显低于突变型,可见MTHFR基因第1298位的密码子的多态性与5-FU的敏感性相关。 MTHFR基因的多态性对于预后的影响至今仍有争议。一项包含有1067例接受含5-FU化疗的乳腺癌患者的研究结果显示，MTHFR基因第667位CT的变异与进展期乳腺癌的长期生存时间相关，但与早期乳腺癌预后无明显相关性，其具体机制不明23。但是在2006年有两项研究24-25发现，对于接受含5-FU治疗的结肠癌和食管癌患者，其MTHFR基因的多态性与预后无关。6 尿嘧啶脱氧核糖三磷酸（dUTP）核苷酸水解酶（dUTPase） TS活性抑制可致大量dUTP的积聚，dUTP直接掺入DNA，抑制DNA链的延长，还可以改变DNA的稳定性，继而引起DNA链断裂，最终导致细胞的死亡。dUTPase的过表达将限制dUTP的聚集，引起TS相关的细胞毒性药物的耐受；而dUTPase的低表达使得dUTP聚集，从而提高药物的敏感性。关于dUTPase与5-FU的敏感性关系的报道较少，Ladner等26发现肿瘤组织细胞核中dUTPase过度表达的患者对以5-FU为基础的化疗不敏感，疾病进展时间和生存期也较短。但是目前仍缺乏大样本的研究来证实此结论。 7 展 望 现阶段临床上进行化学药物治疗常见的难题是肿瘤耐药和化疗药物的毒性反应，未来化疗的最终目的是实现根据肿瘤的反应以及宿主毒性反应的个体化治疗模式。随着检测技术的进步和检测结果评价的标准化，可以通过对接受含5-FU化疗的患者相关药物代谢酶分子表型和肿瘤基因型进行分析，在给药前对患者进行药理学筛选，从而制定个体化治疗方案，达到最佳治疗效果。 参考文献 1Fukushima M，Fujioka A，Uchida J，et al.Thymidylate synthase（TS）and ribonucleotide reductase（RNR）may be involved in acquired resistance to 5-fluorouracil（5-FU）in human cancer xenografts in vivoJ.Eur J Cancer,2001，37(13):1681-1687. 2Amatori F，di Paolo A，del Tacca M，et al.Thymidylate synthase，dihydropyrimidine dehydrogenase and thymidine p