分光光度法讲义.doc

分光光度法云南先锋化工有限公司质量监测中心1、分光光度法引言（1）概念：分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析的方法。（是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的一项技术。）（2）阐述概念：在分光光度计中，将不同波长的光连续地照射到一定浓度的样品溶液时，便可得到不同波长相对应的吸收强度。如以波长（）为横坐标，吸收强度（A）为纵坐标，就可绘出该物质的吸收光谱曲线。利用该曲线进行物质定性、定量的分析方法，称为分光光度法，也称为吸收光谱法。用紫外光源测定无色物质的方法，称为紫外分光光度法；用可见光光源测定有色物质的方法，称为可见光光度法。它们与比色法一样，都以Beer-Lambert定律为基础。 上述的紫外光区与可见光区是常用的。但分光光度法的应用光区包括紫外光区，可见光区，红外光区。 （3）特点：灵敏度高、精确度高、操作简便、快速。对于复杂的组分系统，无须分离即可检测出其中所含的微量组分的特点。（4）波长范围(1)200400nm的紫外光区，(2)400760nm的可见光区，(3)2.525m(按波数计为4000cm400cm)的红外光区。 2、分光光度法的原理 Lambert定律：一束单色光在通过透明溶液时，由于溶液吸收一部分光能，使光的强度减弱，若溶液浓度不变，则溶液的厚度越大，光线强度的减弱也越显著，即光吸收的量与溶液的厚度成比例关系。若以I0表示入射光强度，I表示透过光强度，L表示溶液的厚度，而I/ I0表示光线透过溶液的程度，称为透光率，用T表示，则T= I/ I0。K为消光系数，在入射波长、溶液种类和温度一定的条件下，K是一个定值。 Beer定律：一束单色光在通过透明溶液时，若溶液的厚度不变，则溶液浓度愈高，光线强度的减弱也愈显著，即溶液对光的吸收与溶液的浓度成比例关系。分光光度法的原理 Lambert-Beer（朗伯比尔）定律：如果同时考虑液层厚度和溶液浓度对光吸收的影响，将Lambert和Beer定律合并，描述物质对单色光吸收强弱与液层厚度和待测物浓度的关系。A=kcl3、如何求被测组分的含量(1).利用标准管计算测定物的含量 在相同条件下测定已知浓度（CS）标准液的吸光度（AS），同时也测定末知浓度（CU）的吸光度（AU），(2)利用标准曲线计算测定物含量 先配制一系列浓度由小到大的标准溶液，分别测出它们的吸光度。然后以各管吸光度（A）为纵坐标，各管的浓度（C）为横坐标，在方格坐标纸上作图。 若被测物质对光的吸收符合光的吸收定律，则必然得到一条通过原点的直线，即标准曲线，亦称工作曲线。以后对未知浓度物质测定时，无需再作标准管，据测定管吸光度从标准曲线上即可求得测定物的浓度。 在一定条件下，工作曲线是一条直线，直线的斜率和截距可以用最小二乘法求得。Y=a+bx工作曲线应定期校准。当条件有变动时，例如仪器经过修理、更换光源、更换标准溶液、试剂重新配，都应重新制作工作曲线。4、应用实例：4.1中控分析：废水中甲醇含量的测定；生化废水中CODcr （催化快速法）、 NH3-N（纳氏试剂比色法）、 C6H5OH（4-氨基安替吡啉光度法）；液氧、液空中油含量的测定；4.2原材料分析：煤焦灰成分分析中二氧化硅的测定（硅钼黄光度法）；二氧化钛的测定；4.3水质环境监测分析：4.3.1水质分析：SiO2 、 PO43- 、 Fe、余Cl2、NH4+、NO2- NO3- 、浊度、Cu、水质色度的测定；4.3.2环境监测站：1#、3#排口CODcr （催化快速法）、 NH3-N（纳氏试剂比色法）、 C6H5OH（4-氨基安替吡啉光度法）；硫化物测定（亚甲基蓝分光光度法）；石油类（红外分光光度法）；砷含量的测定 （ 二乙氨基二硫代甲酸银光度法）；氟化物的测定 （ 氟试剂分光光度法）；4-氨基安替吡啉光度法1 测定原理挥发酚类化合物于pH=10.000.20介质中，在铁氰化钾存在下，与4-氨基安替比林反应，生成橙红色的吲哚酚安替比林染料，其水溶液在510nm波长处有最大吸收。用分光光度法测其含量。本法适用于含酚浓度为0.002mg/L6mg/L的含酚废水。2 试剂、材料2.1硫酸溶液：1+3溶液；2.2磷酸溶液：1+9溶液；2.3 4-氨基安替比林溶液20g/L: 称取2g4-氨基安替比林(C11H13N3O)溶于水中稀释至100mL 置冰箱中保存,可使用一星期；2.4 铁氰化钾溶液80g/L：称取8g铁氰化钾(K3Fe(CN)6)溶于水稀释至100mL 置冰箱中保存可使用一星期；2.5 硫酸铜溶液：100g/L；2.6 氨-氯化铵缓冲溶液（pH10）：称取20g氯化铵（NH4Cl）溶于100mL氨水中，加塞，置冰箱中保存；2.7 苯酚标准溶液：1mL溶液含0.01mg苯酚；2.8 甲基橙指示剂：1g/L。3 仪器3.1 分光光度计；3.2 电炉：800W；3.3 圆底蒸馏烧瓶：500mL，带支管；3.4 蛇形冷凝管；3.5 容量瓶：棕色，250mL；4 分析步骤4.1 标准曲线的绘制于50mL比色管中分别加入0.50、1.00、3.00、5.00、7.00、10.00、12.50mL酚标准溶液(2.7)，定容。加0.50mL氨-氯化铵缓冲溶液(2.6)，混匀，此时pH值为10.00.2，加1.00mL4-氨基安替比林溶液(2.3)，混匀。加1.00mL铁氰化钾溶液(2.4)，充分混匀后放置10min,于510nm波长处，用2cm比色皿，以试剂空白为参比，测其吸光度，并绘制标准曲线。4.2 水样测定4.2.1 水样预处理取200.0mL水样置于蒸馏烧瓶中，加23粒玻珠，加2滴甲基橙指示剂(2.8)，用磷酸溶液(2.1)或用硫酸溶液(2.2)调节至pH=4左右（溶液呈橙红色），加入10mL硫酸铜溶液(2.5)。连接冷凝器，加热蒸馏，馏出液收集到250mL容量瓶中，至馏出液约180mL时，停止加热，定容。4.2.2 水样的比色测定取适量馏出液于50mL比色管中，定容。以下步骤同4.1，测其吸光度。4.3 结果计算挥发酚以苯酚(C6H5OH）的质量浓度计，数值以毫克每升（mg/L）表示，按下列公式计算： C6H5OH，mg/L= 式中： E 吸光度读数； a 截距（回归直线方程）； k 斜率的倒数（回归直线方程）； V 移取馏出液的体积的数值，单位为毫升（mL）。2.6 注意事项2.6.1 蒸馏前须检查蒸馏装置是否漏气，无误后开始进行蒸馏；2.6.2 往蒸馏瓶中加数粒玻璃珠，以防溶液暴沸；2.6.3 蒸馏前加硫酸铜的目的是除去试样中的硫化物，以免硫化物在酸性环境中转化为硫化氢与析出的碘作用，使结果偏高。所以加入硫酸铜溶液后产生较多量的黑色硫化铜沉淀，则应摇匀后放置片刻，待沉淀后，再滴加硫酸铜溶液，至不再产生沉淀为止；2.6.4 蒸馏过程中，如发现甲基橙的红色褪去，应在蒸馏结束后，再加1滴甲基橙指示液。如发现蒸馏后残液不呈酸性，则应重新取样，增加硫酸或磷酸加入量，进行蒸馏；2.6.5 4-氨基安替比林固体试剂易潮解氧化，应保存在干燥器中；2.6.6 氨-氯化铵缓冲溶液使用时应避免氨的挥发所引起pH值的改变，注意在低温下保存和取用后立即加塞盖严，并根据使用情况适量配制。3、分光光度计的基本结构4、721分光光度计操作步骤 开机，预热30分钟 转动波长旋钮，调所需波长。按 键切换到透射比档 将遮光体放入光路中，合上盖，按 键校零 开盖，将参比液按空白液、标准液、待测液顺序放入比色皿架上，合上盖，按 键切换到 拉动比色架拉杆，将空白液放入光路中，合上盖，按 键校零 拉动拉杆，将标准、待测液依次放入光路中 ，切换到A档即可读取其吸光度A 读数后，将黑体放入光路中，开盖取出比色皿 将参比液倒回原试管中，清洗比色皿并晾干 关机，盖上防尘盖，登记仪器使用登记本。分光光度计使用的注意事项（在使用仪器前，必须仔细阅读其使用说明书） （1）比色皿应相匹配性（对光的吸收和反射应一致），不得随意挪用。否则将使测试结果失去意义。在进行每次测试前均应进行比较。具体方法如下；分别向被测的两只杯子里注入同样的溶液，把仪器置于某一波长处，石英比色杯；220nm、700nm装蒸馏水，玻璃比色杯：700nm处装蒸馏水，将某一个池的透射比值调至100%，测量其他各池的透射比值，记录其示值之差及通光方向，如透射比之差在0.5%的范围内则可以配套使用，若超出此范围应考虑其对测试结果的影响。（2）比色皿应持其侧壁的毛玻璃面。（3）盛液时达到比色皿的3/4即可，不能太满，外壁如有液体，只能用滤纸沾去水份，再用擦镜纸擦干净。（4）测毕，比色液一般应倒回原试管中，直至计算无误后方可倒掉。（5）若大幅度改变测试波长，需稍等片刻，等灯热平衡后，重新校正0和100%点。然后再测量。（6）比色皿使用完毕后，请立即用蒸馏水冲洗干净，并用干净柔软的纱布将水迹擦去，以防止表面光洁度被破坏，影响比色皿的透光率。 （7）操作人员不应轻易动灯泡及反光镜灯，以免影响光效率。（8）分光光度计由于其光电接收装置为光电倍增管，它本身的特点是放大倍数大，因而可以用于检测微弱光电信号，而不能用来检测强光。否则容易产生信号漂移，灵敏度下降。针对其上述特点，在维修、使用此类仪器时应注意不让光电倍增管长时间暴露于光下，因此在预热时，应打开比色皿盖或使用挡光杆，避免长时间照射使其性能漂移而导致工作不稳。 （9）放大器灵敏度换挡后，必须重新调零。分光光度计检定(测试)的主要项目对分析结果的影响 1)波长准确度 分光光度法原理要求照射在样品池上的单色光必须对应于样品吸收光谱中的某一个吸收峰的波长。由于仪器的制造和调整误差，单色光的实际波长与仪器的波长读数值间都存在一定的误差。样品中绝大部分的主要吸收峰都有一定的宽度，对波长准确度要求允许宽些。但是，当吸收峰宽度较小，而且吸收峰两侧边缘比较陡直，此时波长准确度的影响就必须引起注意。 2)透射比（吸光度）准确度 很显然,透射比或吸光度的误差越大,测试结果的可信性越差,从而影响到测试数据的准确性. 3)杂散光 杂散光是由于光学元件制造误差以及光学和机械零件表面的漫反射形成的。杂散光是分析样品的非吸收光，随着样品浓度的增加，杂散光的影响也随之增大，将给分析结果带来一定的误差。在紫外的短波区域光源强度和检测器的灵敏度均明显减弱，杂散光的影响更不能忽视。因此，杂散光的大小也是仪器性能的一项重要指标。 1）仪器不能调零。可能原因： a）光门不能完全关闭。解决方法：修复光门部件，使其完全关闭。 b）透过率100%旋到底了。解决方法：重新调整100%旋钮。 c）仪器严重受潮。解决方法：可打开光电管暗盒，用电吹风吹上一会儿使其干燥，并更换干燥剂。d）电路故障。解决方法：送修理部门，检修电路。 2）仪器不能调100%。可能原因： a）光能量不够。解决方法：增加灵敏度倍率档位，或更换光源灯（尽管灯还亮）。b）比色皿架未落位。解决方法：调整比色皿架使其落位。c）光电转换部分老化。解决方法：更换部件。d）电路故障。解决方法：调修电路。 3)测量过程中,100%点经常变动。可能原因： a）比色皿在比色皿架中放置的位置不一致，或其表面有液滴。解决方法：用擦镜纸擦干净比色皿表面，然后将其安放在比色槽的左边，上面用定位夹定位。b）电路故障（电压、光电接收、放大电路）。解决方法：送修。 4)数显不稳。可能原因： a）预热时间不够。解决方法：延长预热时间至30分钟左右（部分仪器由于老化等原因，长时间处于工作状态时，也会工作不稳）b）光电管内的干燥剂失效，使微电流放大器受潮。解决方法：烘烤电路，并更换或烘烤干燥剂。c）环境振动过大、光源附近空气流速大、外界强光照射等。解决方法：改善工作环境。d）光电管、电路等其它原因。解决方法：送修。 提高分光光度计透射比检定及使用精度的几种方法 在分光光度计的使用或检定中,透射比(吸光度)的准确度是衡量仪器工作性能的一项重要指标,它的准确程度直接关系到所测数据的可信性及科学性。所以提高此项指标的使用及检定准确度显得尤为重要。下面结合近年来对分光光度计的检定或修理实践,把如何提高透射比的测试及使用精度的几点方法列表叙述如下：1）比色皿架及比色皿在使用中的正确到位问题。有些使用者对这个问题不够重视，因操作不当造成偶然误差，严重影响分析结果。首先，应保证比色皿不倾斜放置。稍许倾斜，就会使参比样品与待测样品的吸收光径长度不一致，还可能使