蛋白及其抗体制备的综合实验综述.doc

综述蛋白及其抗体制备的综合实验一简述IgG的基础理论与临床应用价值.免疫球蛋白的基本结构 Ig分子的基本结构是对称的四条多肽链，即两条相同的轻链（L链）和两条相同的重链（H链），借链间二硫键连结而成“Y”字型单体分子.IgG是生物体液内主要的Ig，约占血液中Ig总量的7075%。由于IgG能通过胎盘，所以新生儿从母体获得的 IgG在抵抗感染方面起重要作用。婴儿出生后24周开始合成IgG，8岁以后血清中IgG可达到成人水平。由于IgG较其他类Ig更易扩散到血管外的间隙内，因而在结合补体、增强免疫细胞吞噬病原微生物和中和细菌毒素的能力方面，具有重要作用，能有效地抗感染，这是对人体有利的一面。但某些自身免疫病，如自身免疫性溶血性贫血、血小板减少性紫癜、红斑狼疮以及类风湿等中的自身抗体都是IgG。二简述蛋白质分离纯化原理蛋白质的结构和功能的多态性，比如等电点差别，可以电泳分离；利用分子质量及分子大小，可用分子筛原理，凝胶层析；利用特异性亲和，离子交换层析；或沉降系数，进行离心；或者溶解度不一而进行盐析。所有的方法根本上利用的就是蛋白质结构和功能上的差异。如氨基酸排列，二级结构，三级结构等。三简述机体抗体产生的机制和生物学意义机制：抗原初次出现在机体内，被机体免疫系统识别，激活免疫系统，进行抗原的吞噬，暴露相关的抗原决定簇，并提呈到B淋巴细胞，刺激使其分化，一部分成为浆细胞，产生相应的抗体，中和体内抗原，另一部分分化成为记忆B细胞，当相同的抗原再次进入机体，可以迅速增殖分化成相应的效应B细胞，生成大量抗体，产生更强烈的免疫反应。意义：1抵御外界抗原的入侵。2清除机体内的变异细胞。四简述抗体鉴定有关理论抗体具有特异性，能和相应的抗原结合，起抗原-抗体反应。免疫火箭电泳法、单向扩散法、免疫电泳法、ELISA法、免疫透射比浊法和放射免疫沉淀法。都是以这个原理为中心的。只是显示系统有所差别。五论述免疫散射比浊法原理及其实际应用价值一定波长的光沿水平轴照射，通过溶液使遇到抗原抗体复合物粒子，光线被粒子颗粒折射，发生偏转，光线偏转的角度与发射光的波长和抗原抗体复合物颗粒大小和多少密切相关。散射光的强度与复合物的含量成正比，即当抗体过量时，待测抗原越多，形成的复合物也越多，散射光也越强。散射光的强度还与各种物理因素，如加入抗原或抗体的时间、光源的强弱和波长、测量角度等密切相关。散射比浊法又分为速率散射比浊法和终点散射比浊法。应用：用于检测血浆、体液中的特定蛋白系列，如免疫球蛋白、补体、血浆蛋白如前白蛋白，白蛋白，等。还可对特定蛋白成分进行定量检测。六评价这次实验教学的安排和学习方法的科学性本次实验教学，跨度时间长，抗体的制备，对动物的免疫，抗体的鉴定等，让我们有相当多的动手机会，通过本次实验，加深了对机体免疫行为的认识，并也深刻理解了抗体抗原的相关理论知识，让我们在实验中学到了更多。七实验部分抗原免疫动物产生的抗体是血清-球蛋白的一部分。-球蛋白是一组结构相似，但又有差异的蛋白质，通称为免疫球蛋白，按其结构和免疫化学性质的差异，又可分为五类，分别称为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE, 抗体以IgG最为稳定。因蛋白在体液中含量不同以及分离纯化的难易的差别，可分别采用多克隆抗体制备法和单克隆抗体制备法。一目的 本实验主要以临床检验应用为目的，培养学生的综合分析和实际操作能力。 二. 蛋白质提取纯化 (纯化ApoB为例)1, 提取 采人外周血液(不抗凝)，离心得血清，用半饱和硫酸铵沉淀球蛋白，弃上清，留沉淀（球蛋白部分）2,纯化上柱层析，分部收集，浓缩，冰冻干燥，80保存3,鉴定(1) 电泳，观察每组份电泳带，若为单一带即为免疫纯。(2) 估价分子量，通过SDS-PAGE估价分子量(3) pI测定，通过等电技术测定pI(4) 氨基末端分析（C-末端，N-末端）(5) 用已知抗体进行免疫鉴定三. 抗体的制备 1多克隆抗体的制备 (1)抗原：目前所知的蛋白进入异种机体后，能致敏淋巴细胞，与抗体产生特异性结合复合物，即具备有抗原性。抗原性包括免疫原性和抗原特异性两方面的含义。具备抗原特异性和免疫原性的蛋白称为完全抗原，大多数动物的免疫系统是非常敏感的，用于免疫的抗原仅需要极微量。抗原应该是纯化品，该纯品在12.5的PAG电泳后，仅出现一条区带，即认为可用于免疫抗原纯品。先用大白兔，为批量生产，以后采用山羊或绵羊。(2) 佐剂：佐剂是指与抗原混合注入机体后，能增加抗原的免疫性或者能改变免疫反应类型的一种物质。人们公认的佐剂是福氏佐剂(Freundadjuvant)，具有明显的免疫刺激作用。福氏佐剂又可分为两种，即不完全佐剂和完全佐剂，属于一种油包水的乳剂，由羊毛脂或甘露糖醇单油酸酯为乳剂。油包水乳化剂有助于促进免疫反应的进行，还可起部分保护不稳定抗原的作用，使抗原在体内的吸收期延长，从而减少加强注射的次数。在不完全佐剂内加入杀死的分枝杆菌(如结核杆菌或卡介苗)制备成完全佐剂。分枝杆菌能增加局部淋巴结的炎症反应，扩大免疫原性，从而促进最终高亲和力抗体的形成。佐剂有成品购买，也可自行制备。不完全佐剂和完全佐剂，均贮存于08。临用时，取完全佐剂3份加入含抗原的缓冲液l份，混匀，振摇或研磨，使其成为乳化状态，因为含有SDS很易促使其乳化成油包水抗原乳化复合物。注射入动物体内时一定要保持乳化状态。抗原用量视抗原分子量不同及免疫原性及免疫动物不同而有一定差异，无统一标准和固定模式。一般是每兔(约2kg重)或每羊(约20kg重)第1次注射抗原1mg，以后逐次增加抗原量，最多每次不超过3mg。(3) 免疫途径及方法：免疫部位可分别选用皮内、皮下或淋巴结。第1次免疫采用皮内结合皮下多点注射，常注射在背部或腿部。许多作者介绍在后足皮下或皮内注射，因为四足落地的关系很易造成感染，使第1次免疫失效，并使动物行走不便，造成伤害。整个免疫过程以23个月为宜。一般是第1次免疫后的34周再进行第2次免疫，不完全佐剂为乳化剂，2周后加强1次(不完全佐剂)，2周后又加强1次(不完全佐剂或完全佐剂)，l周后再免疫1次。待最后一次免疫后的7一10天，取静脉血测试抗体效价(试血)，效价达到要求后即可一次性放血，采用颈动脉放血，得抗血清。 (4) 抗血清的获得与保存：免疫成功的动物放血过程，所有用具均严格消毒，并按无菌操作方式进行放血。抗血清的防腐剂以0.05叠氮钠为宜,也可采用加入2030无菌甘油保存的方法。若时间较长，不用可采用20低温保存。一般在08保存1年，抗体效价几乎无改变，保存2年，其效价稍有降低。抗体切忌反复冻融，否则抗体效价很快降低，以颈动脉一次性放血为宜。(5) 单克隆抗体的制备: 单克隆抗体是一种高度特异性的抗体。单克隆抗体与多克隆抗体有一定的差别。单克隆抗体在腹水中含量较高，可以人工培养，专一性强等特性是多克隆抗体无法比拟的优点。四抗体的检测抗体检测可分别采用免疫火箭电泳法、单向扩散法、免疫电泳法、ELISA法、免疫透射比浊法和放射免疫沉淀法。 (一) 免疫扩散法 原理:可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散,彼此相遇后形成一定类型的特异性沉淀线.沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原抗体的特异性及相互间比例,而且与其分子大小及扩散速度相关.当抗原、抗体存在多个系统时,可呈现多条沉淀线乃至交叉反应.依据沉淀线的形态、条数、清晰度及位置可了解抗原或抗体的若干性质,如浓度、特异性等. 实验材料 0.8%琼脂糖(巴比妥缓冲液配制管,每管约4ml) 载玻片 打孔器微量加样器及塑料吸头 抗原：人全血清、ApoB蛋白、HA蛋白、HC蛋白抗体：兔抗人ApoB、兔抗人全血清、兔抗鼠HA蛋白、兔抗鼠HC蛋白湿盒 实验方法 1)将已溶化的0.8%琼脂管放58-60水浴箱中平衡温度备用. 2)将载玻片置于水平桌面上,倾注已溶化琼脂3.5-4ml,使成厚度约1.5mm琼脂板(注意:倾 注速度不要过快,以免琼脂溢出载玻片;倾注过程要连续以保证琼脂板均匀平滑).3)琼脂凝固后,用打孔器打孔,根据不同需要可制成三角型、方阵型或梅花型,本次试验采用三角型,即每三个孔组成一个三角型. 4)用微量加样器加10l抗体于一孔中,所余两孔分别各加10l不同抗原;或用微量加样器加10l抗原于一孔中,所余两孔分别各加10l不同抗体.注意每加一样品均需更换吸头,以防止交叉污染,影响实验结果. 5)作好标记,放湿盒中,置37温箱,24小时后观察结果. 实验结果 判断家兔体内所产生的抗体:如果两孔中抗原相同,则形成融合性沉淀孤,为同一性反应. 如果两孔中的抗原完全不同,则两沉淀线独自形成并形成交叉,说明为非同一性反应. 如果两孔中抗原有相同成分又有不同成分,则融合性沉淀弧出现支线,见图1-1.(二)免疫电泳扩散原理:免疫电泳扩散是将琼脂电泳与琼脂免疫扩散相结合的一种免疫化学分析技术.在电场作用下标本中各组分因电泳迁移率不同而分成区带,然后沿电泳平行方向将凝胶挖一沟槽,将抗体加入沟槽内,使抗原与抗体相互扩散而形成沉淀线.根据沉淀线的数量、位置及形状,分析标本中所含各组分的性质,本实验常用于抗原分析及免疫性疾病的诊断.实验材料1%琼脂糖凝胶（实验前加热溶解置56-60水浴箱中平衡温度备用）免疫电泳用玻片抗原：人全血清、ApoB蛋白、HA蛋白、HC蛋白抗体：兔抗人ApoB、兔抗人全血清、兔抗鼠HA蛋白、兔抗鼠HC蛋白微量加样器及塑料吸头尖吸管及橡皮吸头打孔器、解剖刀、尺、湿盒等电泳仪:将pH8.6巴比妥缓冲液注入电泳槽内（注意正负极各槽内所加入的量应在同一水平）,并将滤纸裁至适当长度和宽度以备搭桥使用.实验方法1)将溶化的0.8%琼脂糖凝胶倾注于玻片上制成琼脂板.2)琼脂板冷却凝固后,按照模板于挖槽线上中下两侧各打一个孔, 按模板位置用解剖刀挖横槽，并分别用微量加样器在孔內加入人全血清15ul.3)将琼脂板置于电泳槽内,注意电泳标本应放负极“”一侧.并将已浸透缓冲液的纱布一端覆盖于琼脂板两侧各约0.5cm,另一端浸于电泳液中.4)接通电源,电压、电流及电泳时间应视仪器性能而定.一般电压100伏, 电流20MA,泳动时间1小时.5)电泳完毕,关闭电源,取出琼脂板,用特制尖吸管在横槽內加入抗体. 6)将琼脂板置于湿盒中,于37温箱中扩散24小时. 实验结果:观察沉淀弧的位置、形状以及数量，并判断家兔体内所产生的抗体，见图 (三)免疫火箭电泳 原理 在电场中,带电荷的抗原在含有特异性抗体的琼脂糖凝胶中泳动,PH8.6时, 人全血清或Ha蛋白或P蛋白向阳极移动,在泳动途中与凝胶中的抗体反应结合成抗原抗体复合物,通过复合物形成与溶解的交替过程,逐渐形成类似火箭沉淀峰.其峰高与蛋白浓度成正比. 实验材料琼脂糖巴比妥钠缓冲液(=0.05，pH=8.6):巴比妥钠10.30g,巴比妥1.84g、甘氨酸1.0g、Peg 60004g,加900ml水加温助溶,待冷,加1mol/L调pH至8.6，混匀,转入1000ml容量瓶内,再加水到刻度,测试pH后装瓶待用.抗原：人全血清、ApoB蛋白、HA蛋白、HC蛋白抗体：兔抗人ApoB、兔抗人全血清、兔抗鼠HA蛋白、兔抗鼠HC蛋白考马斯亮蓝染色液实验方法1)用巴比妥钠缓冲液配制0.8%琼脂糖液,在水浴煮溶,置56水箱备用.2) 0.8%琼脂糖4ml再加兔抗鼠Ha蛋白血清、兔抗鼠P蛋白血清40l,充分混和, 即倒在载玻片上,待凝.3)在凝胶板上用打孔器打孔,孔径3mm.用微量进样器准确在孔中加入稀释的人全血清或Ha蛋白或P蛋白液体15l.5)置凝胶板于水平电泳槽内,两极用纱布搭桥,抗原一端接阴极,另一端接阳极. 6)以电压100V通