基因工程(上)DNA重组技术的基本工具、基因工程的基本操作程序(选修3).doc

专题1 基因工程【基础知识梳理】一、基因工程的工具1、基因工程的概念：按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。2、DNA重组技术的基本工具（1）限制酶全称：限制性核酸内切酶来源：主要从原核生物中分离纯化出来特点：识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。结果：产生黏性末端或平末端（2）DNA连接酶类型：根据酶的来源不同，可分为EcoliDNA连接酶和T4DNA连接酶作用：连接双链DNA片段，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二脂键。（3）载体种类：通常利用质粒作为载体，另外还有噬菌体的衍生物、动植物病毒等质粒：化学本质：小型环状DNA分子 特点：能自我复制 有一个至多个限制酶切割位点 有特殊的标记基因二、基因工程的基本操作程序1、目的基因的获取途径（1）目的基因： 编码蛋白质的结构基因 。（2）获取目的基因的方法：从基因文库中获取利用PCR技术扩增目的基因通过DNA合成仪人工合成（3）PCR技术扩增目的基因原理：DNA双链复制过程：第一步：加热至9095DNA解链；第二步：冷却到5560，引物结合到互补DNA链；第三步：加热至7075，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。2、基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。（1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。（2）组成：目的基因启动子终止子标记基因（如抗生素基因）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段 ，位于基因的尾端。标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。3、将目的基因导入受体细胞生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法显微注射技术Ca2处理法受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程将目的基因插入Ti质粒的TDNA上农杆菌导入植物细胞整合到受体细胞的DNA表达将含有目的基因的表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵发育获得具有新性状的动物Ca2处理细胞微生物细胞壁的通透性增加重组质粒与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子4、目的基因的检测与鉴定（1）利用DNA分子杂交技术检测目的基因的有无（2）利用分子杂交技术检测目的基因的转录（3）利用抗原抗体杂交检测目的基因的翻译（4）利用个体生物学水平的检测鉴定重组性状的表达【要点名师透析】一、基因工程的工具1、与DNA有关的酶（1）四种酶的比较(2)限制酶和DNA连接酶之间的关系图示2.载体(1)作为载体的条件能在宿主细胞中稳定保存并大量复制。有一个至多个限制性核酸内切酶切割位点，以便与外源基因连接。具有特殊的标记基因，便于筛选。(2)种类质粒：一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。噬菌体的衍生物。动植物病毒。(3)作用作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞内；利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。二、基因工程的基本操作程序1.目的基因的获取(1)直接分离法：从自然界已有的物种中分离，如从基因组文库或cDNA文库中获取。(2)人工合成目的基因如果基因比较小，核苷酸序列又已知，可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。以RNA为模板，在逆转录酶的作用下人工合成。2.基因表达载体的构建(1)基因表达载体各个组成的作用启动子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端，能使转录在所需要的地方停下来。标记基因：作用是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，如抗生素抗性基因。(2)基因表达载体的构建步骤3、将目的基因导入受体细胞受体细胞：细菌 氯化钙细胞壁的通透性增大重组质粒进入受体细胞目的基因随受体细胞的繁殖而复制4、目的基因的检测与鉴定(1)分子水平检测导入检测：DNA分子杂交技术，用放射性同位素标记的含目的基因的DNA片段作探针。转录检测：分子杂交法，用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。翻译检测：抗原抗体杂交法。(2)个体生物学水平鉴定：对转基因生物进行抗虫或抗病的接种实验，以确定是否具有抗性以及抗性的程度。【感悟高考真题】1、(2011浙江高考)将ada（腺苷酸脱氨酶基因）通过质粒pET28b导入大肠杆菌并成功表达腺苷酸脱氨酶。下列叙述错误的是()A.每个大肠杆菌细胞至少含一个重组质粒B.每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点C.每个限制性核酸内切酶识别位点至少插入一个adaD.每个插入的ada至少表达一个腺苷酸脱氨酶分子【答案】C2、(2011海南高考)回答有关基因工程的问题：（1）构建基因工程表达载体时，用不同类型的限制酶切割DNA后，可能产生黏性末端，也可能产生 末端。若要在限制酶切割目的基因和质粒后使其直接进行连接，则应选择能使二者产生 （相同、不同）黏性末端的限制酶。（2）利用大肠杆菌生产人胰岛素时，构建的表达载体含有人胰岛素基因及其启动子等，其中启动子的作用是 。在用表达载体转化大肠杆菌时，常用 处理大肠杆菌，以利于表达载体进入；为了检测胰岛素基因是否转录出了mRNA，可用标记的胰岛素基因片段作探针与mRNA杂交，该杂交技术称为 。为了检测胰岛素基因转录的mRNA是否翻译成 ，常用抗原抗体杂交技术。（3）如果要将某目的基因通过农杆菌转化法导入植物细胞，先要将目的基因插入农杆菌Ti质粒的 中，然后用该农杆菌感染植物细胞，通过DNA重组将目的基因插入植物细胞的 上。【答案】（1）平 相同 （2）RNA聚合酶识别和结合的部位 Ca2+ 分子杂交技术 蛋白质（3）TDNA 染色体DNA3、（2010全国2高考）下列叙述符合基因工程概念的是AB淋巴细胞与肿瘤细胞融合，杂交瘤细胞中含有B淋巴细胞中的抗体基因B将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株C用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株D自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上【答案】B4、（2010江苏高考）下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，圈l、圈2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：（1）一个图1所示的质粒分子经Sma 切割前后，分别含有 个游离的磷酸基团。（2）若对图中质粒进行改造，插入的Sma酶切位点越多，质粒的热稳定性越 。（3）用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用Srna 切割，原因是 。（4）与只使用EcoR I相比较，使用BamH 和Hind 两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止 。（5）为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入 酶。（6）重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了 。（7）为了从cDNA文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体，然后在 的培养基中培养，以完成目的基因表达的初步检测。【答案】（1）0、2（2）高（3）Sma会破坏质粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因（4）质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化（5）DNA连接（6）鉴别和筛选含有目的基因的细胞（7）蔗糖为唯一含碳营养物质5、（2010浙江高考）在用基因工程技术构建抗除草剂的转基因烟草过程中，下列操作错误的是（A）A. 用限制性核酸内切酶切割烟草茶叶病毒的核酸B. 用DNA连接酶连接经切割的抗除草剂基因和载体C. 将重组DNA分子导入原生质体D. 用含除草剂的培养基筛选转基因烟草细胞【答案】A6、（2009浙江高考）下列关于基因工程的叙述，错误的是A目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物B限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶C人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性D载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达【答案】D7、（2009广东理基）钱永健先生因在研究绿色荧光蛋白方面的杰出成就而获2008年诺贝尔奖。在某种生物中检测不到绿色荧光，将水母绿色荧光蛋白基因转入该生物体内后，结果可以检测到绿色荧光。由此可知 A该生物的基因型是杂合的 B该生物与水母有很近的亲缘关系 C绿色荧光蛋白基因在该生物体内得到了表达D改变绿色荧光蛋白基因的1个核苷酸对，就不能检测到绿色荧光【答案】C8、（2009安徽高考）2008年诺贝尔化学奖授予了“发现和发展了水母绿色荧光蛋白“的三位科学家。将绿色荧光蛋白基因的片段与目的基因连接起来组成一个融合基因，再将该融合基因转入真核生物细胞内，表达出的蛋白质就会带有绿色荧光。绿色荧光蛋白在该研究中的主要作用是A追踪目的基因在细胞内的复制过程B追踪目的基因插入到染色体上的位置C追踪目的基因编码的蛋白质在细胞内的分布D追踪目的基因编码的蛋白质的空间结构 【答案】C9、（2009上海理综）科学家运用基因工程技术将人胰岛素基因与大肠杆菌的质粒DNA分子重组，并且在大肠杆菌体内获得成功表达。图示a处为胰岛素基因与大肠杆菌质粒DNA结合的位置，它们彼此能结合的依据是A基因自由组合定律B半保留复制原则C基因分离定律D碱基互补配对原则【答案】D10、（2009上海高考）人体细胞内含有抑制癌症发生的P53基因，生物技术可对此类基因的变化进行检测。（1）目的基因的获取方法通常包括_和_。（2）上图表示从正常人和患者体内获取的P53基因的部分区域。与正常人相比，患者在该区域的碱基会发生改变，在上图中用方框圈出发生改编的碱基对，这种变异被称为_。（3）已知限制酶E识别序列为CCGG,若用限制酶E分别完全切割正常人和患者的P53基因部分区域（见上图），那么正常人的会被切成_个片段，而患者的则被切割成长度为_对碱基和_对碱基的两种片段。（4）如果某人的P53基因部分区域经限制酶E完全切割后，共出现170、220、290和460碱基对的四种片段，那么该人的基因型是_（以P+表示正常基因，Pn表示异常基因）。【答案】（1）从细胞中分离 通过化学方法人工合成（2）见下图 基因碱基对的替换（基因突变）（3）3 460 220（4）【考点模拟演练】一、选择题1、在基因工程操作中限制性核酸内切酶是不可缺少的工具酶。下列有关限制性核酸内切酶的叙述错误的是()A一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列B限制性核酸内切酶的活性受温度和pH等因素的影响C限制性核酸内切酶可以从某些原核生物中提取D限制性核酸内切酶也可以识别和切割RNA【答案】D2、下图是获得抗虫棉的技术流程示意图。卡那霉素抗性基因(kanR)常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长。下列叙述正确的是()A构建重组质粒过程中需要限制性内切酶和DNA连接酶B愈伤组织的分化产生了不同基因型的植株C卡那霉素抗性基因(kanR)中有该过程所利用的限制性内切酶的识别位点D抗虫棉有性生殖后代能保持抗虫性状的稳定遗传【答案】A3、有关基因工程的叙述正确的是()A限制酶只在获得目的基因时才用B重组质粒的形成是在细胞内完成的C质粒都可作为运载体D蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料【答案】D4、下表基因工程中有关基因操作的名词及对应的内容，正确的是()供体剪刀针线运载体受体A质粒限制性内切酶DNA连接酶提供目的基因的生物大肠杆菌等B提供目的基因的生物DNA连接酶限制性内切酶质粒大肠杆菌等C提供目的基因的生物限制性内切酶DNA连接酶质粒大肠杆菌等D大肠杆菌DNA连接酶限制性内切酶提供目的基因的生物质粒【答案】C5、利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需要的产品。下列选项中能说明目的基因完成了在受体细胞中表达的是()A棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因B大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNAC山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列D酵母菌细胞中提到取人干扰素蛋白【答案】D6、下列关于基因表达载体构建的相关叙述，不正确的是()A需要限制酶和DNA连接酶B必须在细胞内进行C抗生素抗性基因可作为标记基因D启动子位于目的基因的首端【答案】B7、(2011南京模拟)下列有关基因工程中限制酶的描述，错误的是()A一种限制酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列B限制酶的活性受温度影响C限制酶能识别和切割RNAD限制酶可从原核生物中提取【答案】C8、(2011湖南师大月考)甲、乙两图表示从细菌细胞中获取目的基因的两种方法，以下说法中错误的是()A甲方法可建立该细菌的基因组文库B乙方法可建立该细菌的cDNA文库C甲方法要以脱氧核苷酸为原料D乙方法需要逆转录酶参与【答案】C9、基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制酶的识别序列和切点是GGATCC，限制酶的识别序列和切点是GATC。根据图示判断下列操作正确的是()A目的基因和质粒均用限制酶切割B目的基因和质粒均用限制酶切割C质粒用限制酶切割，目的基因用限制酶切割D质粒用限制酶切割，目的基因用限制酶切割【答案】D10、下图是将人的生长激素基因导入细菌B细胞内制“工程菌”的示意图。已知细菌B细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因。判断下列说法正确的是()A将重组质粒导入细菌B常用的方法是显微注射法B将完成导入过程后的细菌涂布在含有氨苄青霉素的培养基上，能生长的只是导入了重组质粒的细菌C将完成导入过程后的细菌涂布在含有四环素的培养基上，能生长的就是导入了质粒A的细菌D目的基因成功表达了导入的标志是受体细胞能产生出人的生长激素【答案】C11、线性DNA分子的酶切示意图 已知某种限制性内切酶在一线性DNA分子上有3个酶切位点，如右图中箭头所指。如果该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、b、c、d四种不同长度的DNA片段。现有多个上述线性DNA分子，若在每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶酶切后，这些线性DNA分子最多能产生长度不同的DNA片段种类数是()A3B4C9D12【答案】C12、质粒是基因工程中最常用的运载体，它存在于许多细菌体内。质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，下表是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)，请根据表中提供的细菌生长情况，推测三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是()A.是c；是b；是aB是a和b；是a；是bC是a和b；是b；是aD是c；是a；是b【答案】A13、(2011福州模拟)据图所示，有关工具酶功能的叙述不正确的是( )A.限制性内切酶可以切断a处，DNA连接酶可以连接a处B.DNA聚合酶可以连接a处C.解旋酶可以使b处解开D.连接c处的酶可以为DNA连接酶【答案】D14、下列关于基因工程及其应用的叙述正确的是()A用氨基酸序列推测合成的目的基因与原基因的编码区中的外显子一致B若要生产转基因抗病水稻，可先将目的基因导入大肠杆菌中，再转入水稻细胞中C用DNA探针能检测饮用水中的重金属物质的含量D作为运载体需有多种限制酶切点，但对一种限制酶而言，最好只有一个切点【答案】D15、(2011北京丰台)科学家创造了“基因敲除”技术：用外源基因整合到小鼠胚胎干细胞的DNA同源序列中，使某一个基因被取代或破坏而失活，形成杂合体细胞。然后将“修饰”后的胚胎干细胞植入小鼠的早期胚胎，生成嵌合体小鼠。科学家已经利用上述技术成功地把人类囊肿性纤维化病的致病基因移植到小鼠身上，培育出了患囊肿性纤维化病的小鼠。下列有关叙述错误的是()A这种嵌合体小鼠长大后，体内存在外源基因，而且可能会遗传给后代B在“基因敲除”中需要用到限制性核酸内切酶、连接酶等C通过上述“基因敲除”技术导致的变异类型属于基因突变D“基因敲除”技术有利于人类对某些遗传因素引发的疾病进行研究【答案】C二、非选择题16、科学家从预期人的生长激素的功能出发，推测相应的脱氧核苷酸序列，并人工合成了双链DNA片段，获得双链DNA。科