诱导甲澡生产可食用油(翻译).doc

（12）专利 （11）文件号：AU-B-73302/91(19)澳大利亚专利局 （10）验证号：660162（54）标题 生产二十二碳六烯酸和含有相同基团的化合物的方法（51）国际专利分类A23D 009/02 A23D 009/00 A23K 001/00 A23K 001/18A23L 001/30 A61K 035/66 C11B 001/00 C12P 007/40 C12P 007/64(21)应用号：73302/91 (22)应用日期：04.02.91（87）PCT 出版号：WO91/11918(30)优先权日（31）号码 479135（32）日期13.02.90 （33）国家：美国（43）出版日期：03.09.91（44）认可验证出版日期：15.06.95（71）应用：马泰克公司（72）发明人：DAVID JOHN KYLE;SUE ELLEN REEB;VALERIE JACQUELINE SICOTTE(74)律师或代理人：FB RICE &CO 28A MONTAGUE STREET BALMAIN NSW 2041(56)以前的文件：AU 21226/88 C12P 7/64 C09F 5/02 AU 657259 67195/90 C12P 7/64 C12N1/14 AU 602376 83003/87 C12P 7/64 C12N 1/20(57) 1一个生产包含至少70%甘油三酯，其中至少20%的脂肪酸残留是DHA的单个可食用油细胞的方法，包括：曝气发酵培养微藻类甲藻能生产单细胞油，包含有限制氮源的营养液，并继续培养，实现了至少10克每升营养液生物细胞密度发酵，其中的营养液中氮源浓度是有限的，足以促使说微藻单细胞油生产至少1.5克每升营养液的浓度，并收获的生物量和生物油含有恢复至少有70的甘油三酯（11）AU-B-73302/(10)66016220.一个生产单个可食用油细胞的三酰甘油中至少包含20%DHA且没有鱼腥味的过程包括：（a）最初加入到发酵罐，营养包括含有大约四分之一的人工海水,1-8的葡萄糖和0.4-0.8的酵母提取物,0.5-1.0g干重/升（约106个细胞/毫升）甲澡 （b）培养甲澡的条件为：温度15-34，和PH在5.09.0之间。 （c）逐步加入糖和酵母提取物，营养液，培养约56小时（d）增加甲澡培养额外的葡萄糖约16小时的额外工作来表示营养液诱导说，来生产单个可食用油细胞。（e）整个培养期间，保持20-30的溶解氧含量。（f）在60到90小时后，收获甲澡细胞。（g）恢复含有至少70%三酰甘油的单个可食用油细胞。25. 从土壤微生物中提取，其中生物单细胞食用油包含至少15的石油，其中包括至少70的三酰甘油中二十二碳六烯酸组成至少15的脂肪酸残留，33.婴幼儿配方奶粉包含一个单细胞的食用油，其中包括至少70的三酰甘油载有至少20的DHA，DHA含有少量的EPA。36. 婴幼食品包含一个单细胞的食用油，其中包括至少70的三酰甘油载有至少20的DHA，DHA含有少量的EPA。国际专利编号：A23L 1/054,1/30，A61K 47/00A23D 9/00,9/02,9/04A23K 1/00,1/18，C12P 7/64C12P 7/40A1国际出版编号：WO 91/11918国际出版日期：22.08.91国际认证号：PCT/US91/00733国际查询日期：04.02.91优先日期 13.02.90专利应用 US 479135（cip）上传 13.02.90申请人（对所有除美国外的指定国家）市场合作；6480DOBBIN ROAD LOLUMBIA MD 21045(US) 72 发明人75发明人、申请人：KYLE,DAVID ,JOHN.1801NARBERTH ROAD CATONSVILLE MD 21228(US) Reeb,SUE,ELLEN(US/US) 74代理商：FIGG,E,ANTHONY,ET.AL;ROTHWELL,FIGG,ERNST& KURZ,1700 K STREET ,N,W #800，WASHINGTON,DC,20006(US).81指定国家：AT(欧洲专利)，AU，BE(欧洲专利)，BR，CA,CH,DE,DK,ES, FR GB,GR,IT,JP,KR,LU,NL,SE,US出版：国际检索报告标题：生产二十二碳六烯酸和含有相同基团的化合物的方法摘要：这个发明是关于生产单个富含DHA，二十二碳六烯酸的油细胞。用微澡类培养法，如甲澡。在发酵液中培养，以诱导生产单个油细胞随后重新与溶剂萃取发明的背景这个发明是关于可食用单个油细胞，包含二十二碳六烯酸（DHA）。这个发明还是关于在商业上可行的生产这种含有DHA的单个油细胞的方法。 DHA是-3脂肪酸和最丰富的长链多不饱和脂肪酸一般酸，已知有利于减少冠心病的发病率的功能。【土地，鱼和人类健康（1986）学术出版】 。但是人们对-3脂肪酸的代谢还不是很了解。因此，确切的临床剂量和疗效仍然不再清楚。冷水海鱼称为-3脂肪酸的来源，包含DHA。美国专利号：4670285，然而，据披露，事实上，作为鱼油来源的鱼类，如鲱鱼和鲱鱼作为C22-3脂肪酸的来源，使用鱼油的主要商业来源的-3-脂肪酸。通常，鱼油不能为人类消费，因为污染环境污染物，如PCB类物质。现在依然有关于含DHA鱼油用于食物的问题。例如，鱼油通常因含有脂肪酸氧化产物鱼腥味和不好的口感。这种过氧化物不好的口感和毒性让鱼油不适于用于可食用产品，如婴儿食品和婴儿配方奶粉。海洋微生物也被知道含有DHA。特别的，各种甲澡含丰富的DHA。“甲澡中的多不饱和脂肪酸，八个光合作用自养甲澡和一个异养甲澡脂肪酸含量的表征。总结出：甲澡酸是海洋食物链数量的贡献实质。成功培养甲澡来生产可食用含DHA的油的方法还没有达到。甲澡通常生长缓慢，而且对剪切力十分敏感。先前文献表明，即使轻微搅拌培养，都会减缓甲澡的生长。但是，适当搅拌是增加溶氧量来达到商业生产最大化生长所必须的。DHA被认为是婴儿大脑和视力发育所必须的，因为，综上所诉，DHA是脑和视网膜中含量最丰富的多不饱和脂肪酸。尽管在哺乳动物体内的代谢途径有从饮食中亚麻酸合成DHA，但这个代谢途径于生物不利。哺乳动物，被认为他们所含的DHA都来自于饮食。至于婴儿，最可能的来源是母乳。的确，DHA是母乳中最丰富的C20 -3多不饱和脂肪酸。然而，通常DHA是婴儿配方奶粉所缺乏的，（美国专利号：4670285）透露一个婴儿配方奶粉含有-3脂肪酸。可是，这些脂肪酸是利用从鸡蛋或鱼油所获得和与其相关的不愉快的特点描述。另外，鱼油中通常含有另一种-3脂肪酸EPA一个婴儿配方奶粉中没有描述的物质，因为他的长期抗凝作用和低水平的花生四烯酸。这已经与婴儿体重增加降低关联。的确，EPA的水平在人乳中的水平很低。（少于四分之一的DHA）。因此，他是目前发明提供单个含有DHA的可食用油分子的目的。最好这种油不含有显著数量的其他不饱和脂肪酸。大于总脂肪酸含量约2.通常，这是一个用于商业生产单个油细胞的最新发明对象。这种油，特点是作为一种“设计者”油。提取后可用于婴儿配方奶粉，婴儿食品，额外食品，药品。另外，它将被用来探究-3脂肪酸的代谢途径。同位素标记是这方面伟大的一步。但是，迄今为止，还没有发现生产大量同位素DHA。因此，提供相当数量的同位素DHA也是目前这个领域研究的一个着手点。 发明总结目前关于培养微生物，尤其是甲澡，用发酵培养诱导它产生显著数量的含高水平DHA的单个油细胞。这里所用到的单个油细胞，指的是一种单细胞生物体的脂类产品。目前的发明也包括突变生物体能提高含至少20%DHA的单个油细胞的能力。目前的发明也包括含15%DHA的单个油细胞和含20%以上DHA的完美单个油细胞。目前的发明提供了一个经济的方法去提高可食用油中的DHA含量。另外，这个方法允许商业培养甲澡提高细胞密度。通过这种方法生产的可食用油细胞没有难闻的口味和鱼腥味。而且没有污染物，而在传统的含DHA油来源中经常发现污染物。本发明还包括食品，含有本发明的油 。 简要说明图纸图表1,2,3都是甲澡生物量随时间推移，各种营养物增加。 详细描述此发明实践的最佳模式与本发明一致，微生物生产含DHA的单个油细胞是通过 发酵培养，能够支持这种生物生长的营养液 。最好这个单个油细胞的DHA含量在20%以上。任何能生产可食用单个油细胞的微生物都可以用到本发明中。例如硅藻就可以用在本实验。首先是海洋甲澡类生物，包括隐甲。特别是异养类甲澡需要预留生长所需的碳源。甲澡是首选，因为它包含脂肪酸，而且DHA是它唯一的多不饱和脂肪酸且含量丰富。 这个有机体的样本，指定MK8840，存放在美国。此处所用微生物，或任何特殊种类微生物，包括野生株，突变株，和重组混合体， 任何能增加油中DHA含量的微生物，都被认为是在本发明的范围内。本发明的特点之一是如甲澡类的微生物被认可的可食用产油的能力和随之而来的解决方案，以维持一个可靠的经济来源。据此，野生型和重组型微生物被设计用来生产含DHA的单个油细胞是本发明的一个方面。这个重组型将包括那些增加单个油细胞中DHA含量，或增加总共油量的设计。在提供相同的底物条件下，比较与野生型的产油量。还包括，将有效地使用更具成本效益的底物而将相同资金投入的微生物作为可比野生型微生物生产含有DHA的单细胞油。通常，传统的经验不会将甲澡作为发酵培养的合适有机体。先前的工作者在成功的培养甲澡的先例下得出结论：甲澡的培养是营养素极其复杂的混合物。相反，目前的发明成功在含葡萄糖、酵母浸出物的简单培养基中生产DHA。这些组件的运用，如海水的应用就显著提高了经济增长率和细胞密度。例如，在3-5天的培养周期，甲澡细胞密度至少在每升溶液10克，通常可以实现每升20至40克。这个密度迄今为止还未实现。尽管可以在适当的发酵罐中培养，有机体最好是在搅动发酵罐或气升发酵罐。这两种培养方式都是所熟知的。当选择搅动发酵法时，搅动是通过涡轮机或高亢的刀片或海洋叶轮。搅拌和喷射更新微生物培养基中的氧容量。搅动频率通常随生物量的增加而增加。因为需氧量也相应增加了。搅拌浆搅动速度不要超过500cm/s,最好也不要超过300cm/s.选择能够承受更大搅拌速度的菌种。菌种的运用在本发明中有明确的指出。综上所述，海水是可以接受的营养液媒介。海水可以是自然的，过滤的或人工混合的，每种都可以稀释来降低盐度，例如从1/2到1/4浓度，用自来水或浓缩至2倍原水平。最好的例子是“即时海洋”牌人工海水。尽管甲澡是海洋微生物，观察有些在无盐度条件下生长。在低盐度下生长良好的变种被特别的用到本发明。微量营养素在低盐度下可能被用到，可是，这种微量营养素在典籍中是知道的，而且普遍存在于海水和自来水中。当有机体是异养型微生物时，例如异养型甲澡，就需要假如碳源。最好，在加入海水到发酵罐后，需要消毒，待冷却后，假如营养物质和菌种。（尽管营养物质和海水一起消毒是可以接受的，但是消毒时可能流失一些葡萄糖。）营养物质和微生物可以同时加入，也可以有次序的加入。一个高效的种子浓度可有由资料查出。当使用搅拌发酵法时，发酵开始时的接种量从每升干重0.5变为1克。这就是说，每毫升有106个细胞，因此，一个30L的发酵罐，在细胞浓度20克干重每升时，需要1-3L的营养液。氧浓度最好控制在至少10%的空气溶氧量。生物合成DHA需要氧气。据此，高产量的DHA需要的溶氧等级在10%-50%间。在生物质密度在25G干重每升时，搅拌速度在150-200cm/s在通风率在1VVM提供氧气等级在20%-30%。高细胞浓度也许需要更高的要浓度，这可以通过提高通气量或增加发酵罐中气压来解决。可用的碳源可以再资料中查出。例如碳源可以用葡萄糖提供给甲澡。其他的异养微生物可以用其他的碳源，由其他微生物特性决定。甲澡也可以在其他混合碳源中生长。通常，发酵是在10-50g每升葡萄糖下启动的。当有需求时，更多的葡萄糖被加到发酵罐中。另外，从50-150克，最好是50-100克葡萄糖每升可以被加入到发酵罐。从而最大限度地减少未来增加的频率。其他有机体碳源的所需要的量由其特性决定。除了碳源，氮源，例如酵母浸出物被加到培养液中。市售酵母浸出物也是可以用的。例如DIFCO或MARCOR牌酵母浸出物就可用。酵母是常用的氮源，也含有微生物。其他常用的氮源也可以视该微生物的特性加入。但是，这种混合氮源通常比酵母浸出物贵。本发明使用变种可以在尿素或硝酸盐上生长的能力。通常发酵在酵母浸出物含量在6-12克每升时启动。当需要时，更多的酵母浸出物可以被使用。一般一个发酵周期，需要8-15克每升酵母浸出物。通常，这个数量的酵母浸出物可以被加入从而最大限度地减少未来增加的频率。精确的数量可以由资料中的特性查出。通常，葡萄糖和酵母浸出物的比例是从2:1到15:1.培养可以在任何可维持生命的温度下进行。通常，甲澡将在15-34范围内生长。最好，温度控制在在20-30。能在高温下生长的菌种是最好的，因为在高温下它们生长迅速，可以减少发酵时间。其他微生物的最适温度变化范围由他们的特性所决定。培养可以在一个很宽的PH变化下进行。通常PH在5.0-9.0下都可以。但是它们的生长阶段最好在6.0-7.0PH下。通常在接种前，也会加入NaOH,KOH,来调节培养液的PH。在发酵的后几个阶段，培养基往往变成碱性。在生长阶段，如果需要的话，可以用无机酸来控制培养液的碱度。甲澡在固定阶段被诱导来生产单个油细胞。酵母浸出液的不足之处是当有葡萄糖残留时，酵母浸出物的缺乏会由于酵母浸出物的用尽而引起。目前的发名认为：碳氮比是提高单个油细胞生产效率的主因。用葡萄糖和酵母浸出液是普遍的。最好的碳氮比是10-15比1.其他微生物的类似比可有通过生物特性计算出来。在诱导生产油后，常规是额外培养24小时。在这个物质合成阶段，含有DHA的单个油细胞被合成，并且形成肉眼可见的油滴。由它的生物特性可以计算出它发酵所需要的时间和所需酵母浸出液的量。当这段时间过去，再额外发酵24小时然后收获。通常，甲澡都会培养直到形成单个油细胞。一般是由60-90小时。尽管这短时间是变化的。用野生型甲澡，有15%-30%提取物，包括可提取油。菌种的选择可以提高这一百分率，本发明也包含了菌种选取的内.最好，生产的油含有的三酰甘油含量超过70%，通常，剩下的脂肪酸15-20% 肉豆蔻酸20-25% 棕榈酸10-15% 油酸30-40% DHA0-10% 其他（其他的油包括：极性液体，例如：磷酯酰胆碱，在DHA中也比较丰富。）原油的特点是橘黄色和常温下是液态。这种油含有至少20%质量分数DHA，最好的油含有至少35%质量分数DHA。生物体通常的收获手段，由典籍可知。例如，离心，絮凝或过滤，可以立即处理，或干燥为接下来的步骤。在任何情况下，油可以比较容易的被一个有效数量的溶剂抽取。合适的溶剂可以由其特殊性质决定。首选溶剂包括纯正己烷和超临界流体，如超临界CO2.超临界流体萃取技术的应用可有资料可知，在Mchugh et al 的书“超临界流体萃取”中也有描述。Butterworth，1966.如果萃取溶剂是正己烷，合适的正己烷来干燥有机体的比例是每千克干有机体四升正己烷。而且，正己烷最好是在20-50下，与有机质在搅拌反应釜反应2小时。混合完毕后，有机体过滤分离得到油。另外，湿的生物质（30-35%固体）可以被极性溶剂直接提取，例如乙醇，异丙醇，或正己烷与异丙醇混合物。剩余的有机质，即提取单个可食用油细胞后的微生物有机质，例如甲澡，可以用来动物饲料。它含有35-40%的蛋白质，8-10%的灰，45-50%的糖类。因为剩余有机物质的高蛋白质含量，和丰富的DHA，全部的剩余有机生物质可以用于水产养殖。溶剂可以通过资料记载的方法从油中分离。传统的油籽加工设备，适合执行过滤. 分离蒸馏。其他的步骤，由资料可得。可以为特定的应用程序如果需要或适宜进行。这些步骤也和传统植物油提炼技术和富含DHA的极性液体分离相似。同位素标记单个油细胞，包括标记DHA，这样可以获得足够数量可供研究的DHA。当13C-葡萄糖或14C葡萄糖被提供作为碳源，来标记DHA。本发明也包含食品生产，例如婴儿配方奶粉和婴儿食品，和膳食补充剂，它含有富含DHA的单个油细胞。资料认为婴儿配方奶粉含有DHA是可取的。早先的配方奶粉中的DHA是来自鱼油，但这种鱼油的味道不好，和鱼腥味是一个为解决的问题。未来，鱼油作为配方奶粉增补物，包括二十碳五烯酸，一个-3-脂肪酸具有抗凝血活性和可能减少花生四烯酸合成的功能。这种活性在婴儿配方奶粉或婴儿食品中是不可取的，而且在本来没有足够数量的EPA的单个油细胞也是。在本发明中像配方奶粉这样的食品生产，单个油细胞没有难闻的鱼腥味。所以这样的食品是更令人容易接受的。最好，本发明的配方奶粉含有含有0.05%干重的DHA。本发明的婴儿食品，有一个更固定的配比，含DHA的单个油细胞占干重的0.5%以上。在两个实例中，最好的是，油含有至少35%DHA。本实验包含制药生产中含DHA的单个油细胞。最好油含有至少35%DHA。这种制药生产的模范是合适生产适合婴儿或成人的全外肠营养。营养增补物包含单个油细胞。最好，增补物在封装胶囊中，油和可能适用于孕妇或哺乳母亲。这个特别适合那些只吃蔬菜不能获得足够DHA的女性。本发明依然包含含有DHA的单个油细胞。最好这个单个油细胞含有至少20%重量的DHA。最好含有35%。本发明正被广泛接受，参考了以下的非限制性的具体例子。 例1在一个30L的搅拌发酵罐中，装一半的海水培养基。6升的IO和18升的自来水混合。含有培养基的发酵罐经过消毒后，冷却到28。400ml酵母浸出液（455g/l），900ml葡萄糖（400g/l）和从有2X107个细胞/ml或20g/L的种子发酵罐中取一升接种。（产生最终浓度大约为7X106细胞每ml或生物质700mg/L），加入到培养基。搅动速度设为120cm/s,通气量设为30L每分钟。额外的葡萄糖浆(900毫升)增加了30小时后，另一个4.2升在接下来的42小时. 因此总共添加6公升的葡萄糖浆份量。集中酵母浸出液解决方案(400毫升)以每小时6和添加，另一个1.2升在以后的48小时加入,直到共有2.0升已经被增加。保持将超过20%,在24小时内变速风潮是增加到150厘米/秒,在48个小时后变为160厘米/秒。在72小时后，转速增加到200厘米/秒。以往规律获准为一个额外的时间足够长,将最终费用的葡萄糖进入细胞的油。图中描绘的培养条件于本许可证图1。当时的培养物期待与细胞颗粒离心保留。收获的颗粒细胞的冷冻和干燥(冻干)约4%的水分。/环己烷(2.8升)被加入到干生物量和搅拌釜在一个玻璃1.5小时50摄氏度。扶轮蒸发器是用于去除/环己烷、生产大约175克的含DHA的油。 例2 在350 -升工作量发酵罐中都装的一半人工海水与230升的自来水结合水。发酵罐含有培养基灭菌和冷却到28。6.8升集中的特(400 g / 1),12.5升的葡萄糖浆(400 g / 1)和30公升的甲澡由种子接种评判(10个细胞/毫升或一个生物密度大约1.3克/升)又被添加到培养基。搅拌速度设为73厘米/秒变速和曝气是设置在1 VVM(280公升/分钟)。额外的葡萄糖浆(12)升了大约44小时后,另一个43升在接下来的三十二小时。因此,总共有67.5升的葡萄糖浆添加。葡萄糖的增加和细胞生长图形描述表2中可以看出。溶氧量将继续保持在大于20%,在44小时变速风潮是增加到175厘米/秒,55小时至225厘米/秒。在76小时，搅拌速度减少到150厘米/秒，培养液获准为一个额外的足够长时间,将最终费用的葡萄糖进入细胞的油。培养液则是收获。收获的细胞中加入干生物量和搅拌釜在25度干燥2小时。扶轮蒸发器是用于去除/环己烷、生产大约700克的含DHA的油。 例3在一个30-升容积的发酵罐，都装一满的工作腔容积的人工海水介质由结合565克的15公升的自来水。发酵罐含有培养基的超低温杀菌、冷却到28 c。四百毫升的集中酵母浸出液(400 g / 1),1.9升的葡萄糖糖浆(400/1)和1公升的甲澡接种物。从一个种子发酵罐，(106 个细胞 /毫升或一个生物量约2.0克/升)被添加到培养基。搅拌速度设为80厘米/秒，变速和曝气是1 VVM(20升每分)。额外的葡萄糖浆(1.5 - 1)增加了94小时后,另一个1.1升在116小时加入。因此总共405公升的葡萄糖浆被添加 了。将继续保持溶氧量在大于20%,在52小时风潮变速是增加到160厘米/秒。在66个小时,在稳定期,为做到这一点,PH值是设定在4 N KOH到7.0。和变速没有进一步提高搅拌速度的时间运行。如图3、培养液获准额外生长一段时间的时候,这些就足以把最后的葡萄糖进入细胞转化成油。培养液则是收获。收获的细胞被干燥约4%的水分。添加生物质到含己烷乾燥的搅拌釜在50摄氏度下干燥1.5小时。扶轮蒸发器是用于去除环己烷、生产大约65克含DHA的油。这项发明索赔定义如下:1。一个制作含有至少含有70%的甘油三酸酯的单细胞食用油，其中至少20%的DHA的方法,包括:培养微甲澡类的单个细胞能产生单个油细胞.工业发酵培养在养份有限制氮源来源时的解决方案,和不断培养细胞密度达到至少每公升10克生物量养分的解决方案。在氮源完全有限的条件下的氮源浓度，在氮源浓度在至少1.5g每升时来诱导微澡生产单个油细胞，收获的生物质和恢复的含至少70%的三酰甘油的生物质。2. 一中方法，其中，曝气发酵罐含有至少10%的饱和空气等级。3. 1或2中的方法，其中甲澡属于隐甲。4. 3中方法，其中甲澡包括隐形甲澡。5. 4中方法，其中营养包含海水。6. 5中方法，其中海水包括人工海水。7. 6中方法，其中营养源包括用四分之一人工海水。8. 5中方法，其中表明未来的营养包括减少的碳源。9. 8中方法，其中减少碳源包括葡萄糖。10. 5中方法，其中表明有限氮源包括无机氮源。11. 10方法，其中表明氮源包括酵母浸出物。12. 11中方法，其中葡萄糖与酵母的比例是2到4份得葡萄糖比上1份得酵母浸出物。13. 12中方法，将来的维持溶氧量在10-50%的范围内变化。14. 13中方法，其中变化从20-30%.15. 14中方法，其中发酵罐是一个搅动罐，它有一个涡轮或者气升发酵罐。16. 15中方法，其中涡轮搅动营养物，从而给甲澡提供氧气。17. 1中方法，其中搅动的速率是在1VVM。18. 1中方法，其中营养源包括13C葡萄糖和14C葡萄糖。19. 1中方法，其中藻类培养到密度至少在20g每升的营养源。20. 一个生产在三酰甘油中含至少20%的DHA且不含鱼腥味的单个油细胞的过程包括：(a) 在发酵罐中最初加入营养物质，包括四分之一量得人工海水，1-8%的葡萄糖，0.4-0.8%的酵母浸出液，0.5-1.0g干重每升（大约106个每毫升）甲澡细胞。(b) 培养甲澡的温度在15-34间，PH在5.0-9.0间。(c) 增加葡萄糖和酵母浸出物发酵56小时。(d) 加入额外的葡萄糖培养额外的16小时，来诱导甲澡产生单个油细胞。(e) 在整个培养过程中控制溶氧量在20-30%。(f) 在培养60-90小时后收获甲澡细胞。(g) 恢复含至少70%三酰甘油的单个可食用油细胞21. 20中过程，其中恢复包括处理溶剂，例如把油从溶剂中分离出来。 22. 21中过程，其中溶剂包括正己烷，乙醇，异丙醇，正己烷与异丙醇混合物或超临界流体。23. 22中过程，其中在比例4升正己烷与每千克甲澡干生物质，与生物质在20下在搅拌反应釜中反应1小时。24. 23中过程，包括过滤含有油的正己烷，然后用蒸馏方法除去油相中的正己烷。25. 单个可食用油细胞从微澡生物质中提取出来，其中生物质含有至少15%油，这些油包含至少70%的三酰甘油，其中十二碳六烯酸组成至少15%的脂肪酸。26. 25中的油，其中DHA占油相重的至少20%。27. 26中的油，其中DHA占油相重量的至少30%。28. 动物饲料包含单个可食用油细胞提取生物质，培养方式与1相同。29. 28中的动物饲料，其中微生物包含甲澡。30. 水产养殖饲料包括，在生产油条件下的能生产含至少20%DHA的70%的三酰甘油的油细胞的甲澡细胞。31. 30中的饲料，其中水产养殖包括：虾，牡蛎，或鱼。32. 31中的饲料，其中甲澡是C.Cohnii型甲澡。33. 婴儿配方奶粉中包含单个可食用油细胞，这些油细胞中包含至少70%的三酰甘油，甘油含有至少20%DHA，其中没有