三氯乙烯对脂质体膜通透性的影响及其破膜效应.pdf

第 3 卷第 3 期 1987 年 月 生物物理学报 ACTABIOP H YSICAS IN ICA V ol 3No SePt 19 8 7 三氯乙烯对脂质体膜通透性的影响 及其破膜效应 张志鸿 唐莉刘宏志 复旦大学生物物理教研室 摘要 本文通过测定脂质体膜对水的通透性及脂质体对被包裹血红蛋白的释放率 研究了三氯乙 烯对脂质体的作用 观察到在低浓度时 三氯乙烯能增加蛋卵磷脂脂质体的通透性 随着浓度 的增加有破膜释放的效应 引言 近几年 人们对脂质体膜H 相 的非双分子层结构予以相当的关注川 F o rr e st等 2 用 P一N MR波谱法证实了三氯乙烯能引起蛋卵磷脂 EPC 脂质体的H l 相的产生 本 文据此 进一步研究这种膜结构变化对膜通透性 对脂质体内包裹分子释放特性等的影响 材料和方法 一 试剂 EPC系上海禽蛋二厂产品 二豆落酞磷脂酞胆碱 DM Pc 购 自S i gm a 公司 红细胞 系健康人的代浆红 细胞 来自上海市中心血站 三氯乙烯 A R 为北京化工厂产品 二 膜对水分子通 透性的测 定 先制备E Pc 的多层脂质体 3 当在脂质体悬浮液中加入蔗糖高渗液时 脂质体即发生 收缩 依据体积收缩速率可比较膜对水分子的相对通透性 我 们采用一套微机实时处理系 统进行测定和记录 测定三氯乙烯效应时 先使药物和脂质体充分搅 拌混合后作 用 3 omin 再作测定 三 膜对H b释放率的洲定 按S z e b en i等 方法从人红细胞 中提取H b并制备包裹H b的脂质体 取 3m l悬浮液 加 入1 5拌 l不同浓度三氯乙烯的乙醇溶液 室温下振荡3 0垃i n 然后2 4 0 0 0 xg 离心smi n 得 上清液 称为溶液 i 沉淀中加入 Trito n X一0 0 终浓度 0 0 8 60o C 水浴温育 sm i n呈透 明 称为溶液 2 测定溶液 1 与溶液 2 在 414 n m 波长处的光密度 0 D O D 膜对Hb的释放率定义为 O D O D O D 2 四 光做射的侧定 用光散射强度的参数能灵敏地检测悬浮液中脂质体大小的变化 实验中 于2 m l脂质体 2 68 生物物 理 学报 198了年 悬浮液 中注入1 川不同浓度的三氯乙烯乙醇溶液 在日立85 0型荧光分光光度计久 40 0 n 处测定散射强 度 样品室经改装后能使样品杯中悬浮液始终处于磁力搅拌的状态 而且配 有循环水以控制样品杯温度 结果和讨论 一 三级乙漪对脂质休腆的水通透性的彩响 渗透收缩时 一般用脂质体体积收缩速率 v 来比较膜对水的通透性 d l A d t 1 A 口一 一 二匕 1 A A t 式中A是光密度 A 是渗透 收缩起始的光密度 图1是测定结果 可见 随着三氯乙烯浓 度的增加 EPC膜的通透性也增大 当三氯乙烯 EPC 4 1 克分子比 时 脂质体的渗 透收缩现 象消失 表明膜已有 泄漏 的孔道或破裂 用制备大型脂质体的方法 我 们在相 差显微镜下确实看到高浓度三氯乙烯时脂质体的碎片 一 甲 一 Fig 1 Effe et on t五e w ate r o f trie hlo roethvle ne p ermea bility o fEpc Trloh王 or o eLhylen e左P C mo l加01 1iPo som e s T e mPe ratur e w a s 24 O C 二 三抓乙烯对包襄H b脂质体的Hb释放效应 脂质体对H b的包裹率定义为Hb被包入脂质体内部水相的百分率 本实 验 中 对 E PC r 王 o 一 th丫 众言呈 舌 挥 d Fig 2Effe eto f trie hlo r o e t五ylene o n the 五em o globi nr e le as eo fEPC 1iPo so m es an d DMp CliP0 00mos O resPeetive ly 脂质体及DM PC脂质体 包裹率分别为3 3 2 1 H b 的包裹量 Hb g 磷脂 g 对 EpC脂质体为2 2 对 pMp C为0 9 单纯脂质 体及加乙醇的对照组 同样实验条件下对 Hb 的 释放率分别为3 4 及4 2 三氯乙烯作用后 则大大促进了 Hb的释放 结果见图 2 图中纵 轴表示H b的净释放率 即去除 溶 剂 乙醇 效 应的释放率 可 见 对于E PC脂质体 三氯乙烯 EPC超过5 l时 释放量急剧增加 而 当约15 1 之后 达最大释放 Hb最大释放未达1 00 的一 个原因可能是H b和膜磷脂极性头部的 相 互作用 7 为了探明通透性增加及破膜释放H b是否完全 是由于H 相形成的结果 我们用D MPC脂质体作 了对比实验 D MPC分子的两条 尾巴 皆是饱和 欲 习一 c T 刁 们 户 叨 T 尸 N 第 3 期 三氯乙烯对脂质体膜通透性的影响及其破膜效应 26 的烃链 按照其分子堆积特性 难以形成H 相川 但H b 的释放实 验 表明 较低浓度 4 8 1 一 二氯乙烯作用后 同样能引起DMPC脂质体内H b的释放 而且效应还较E Pc的大 图 2 结合这些事实 可以提出这样的解释 当疏水性的三氯乙烯小分子进入膜的疏水区 域时 使DMP C脂质体双分 子层膜产生缺陷 膜稳定性降低 甚至破裂 对 于E PC脂质体 则通过膜流动性的增加及膜 中不饱和烃链成分之间 分 相 所致的局部 H 相 导致膜 通 透性的增加 随着三氯乙烯浓度 的增高则同样使膜结构不稳定 最后破裂 三 三级乙始对脂质体光散射特性的影晌 图 3 显示 三氯乙烯对EPC脂质体光散射效应 的温度特性 随温度的升高 悬浮液的散 射光强跟着下降 对于对照 组 5 一3 5丫范围内呈现线性关系 三氯乙烯浓度增高后则出 现折点 这表明了膜结构上相变过程的存在 另外 一 随着三氯乙烯浓度的增高 折点的位 置朝低温推移 说明膜堵构改变过程中疮变的减刁 一 沐妇 的 u 荆 u 叫 万 斌 刹曰 门 的山 曰 刀 门 l 匕 1 01 5202 30 Te叩erature C Fig 3T e m Pe r atur e doPend en毛eo f the lig ht scatte r ingint ensityo fEpCliPo so m esusPen 5ion tr eated by trichlo oethylene 久二4 oon也 T rie hlo ro ethylene E pcm ola rratio eo ntr ol w ith ethano l o 圣 5 x 9 6 1 4 4 一 1 9 2 我们在对EPC脂质体 DMPC脂质体分别作光散射强度的时间 扫描 20mi n以内 实验 中观察到 两个体系对三氯乙烯有 相反的响应 对于EPC 散射强度随时间呈现S型增强 对于 DMPC 则散射强度单调地下降 这 一结果从另 一方面支持了上述的看法 即 DMPC 脂质体受三氯乙烯作用后很快破裂 这些碎片随即再聚集以降低体系的自由能 因而造成 散射强度的逐渐变小 而E PC脂质体的破膜进程较慢 S型 提示着相变过程的发生 由图 3可知 药物 E P C 4 8 时 散射强度仅增加约 5 2 4 药物 E PC 4 时则 更小 而此时膜通透性的变化却很显著 图1 这说明了根据体积变化速率的测定能较灵 敏地检测 出膜通透性的变化 而用光散射法测定相对散射强度则能较好地追踪破膜的进程 及以后的弛豫过程 至 于通透性变化的详细机制 EPC膜相变中除F o r r eot等人认为的H 相 之外是否还存在其他膜结构的变化尚待进一步探讨 本文 lo se年9月24日收到 270生物物理学报 10 5 7年 参考文献 l G r u ner s M etal n n R ev B ioPhvs Biop hys c hem 14 19 8 5 21一38 2 Fo r re st B J a n dn od ham D K Bio ehim BioPhys A eta 8 14 19 85 281 一2 88 3 刘宏志 张志鸿 程极济 生物化学与生物物理学报 1 8 19 8 6 358 一36 6 4 张志鸿 生物化学与生物物理进展 6 3 98 5 6 7一69 5 s ebeni J etal Bio e五em istry 24 1 98 5 2827 一2 832 6 In ou e T etal Bio e五i也 Biop五 s A eta 812 19 8 5 3 9 3一401 了 张志鸿 朱游洋 复旦学报 自然科学版 2 4 198 5 4 0 1一40 6 E FFECT O N LIPOSOME MEM B RANEPE R M EABILIT Y AN DBREAKAGE OF M E MB RA N EBY T R ICHLOROE THY L E NE Z ha ngZ 五i一ho ng T ang Li a nd LiuH on g 一 z hi B1 0夕h夕51 刀 口 s 石 n F uda n U nioer sit夕 A B ST RA CT 气 Bym eas u rin g thewater Pe rm eabilityof the liPo somean d the release fr a e tion of hemog lobin the ffe etoftriehlor oeth yle ne on liPo s om es was in v estigat ed It was o b s e r ved thattriehloroethyle n e in ere ased the Pe rme abilityofeg g PCliPo s omeat low eoneentration an d eould br e ak u Pthe 扭em b r a ne with in c r e a sin g trieh lo r o eth ylene e one entration T he effe etof te垃Pe r atu r e ons c atterin g inten sity ind ic ated thattrichlo r oethylen e co u ld effe eton the m em bran e Pha se eo n ditio n A eo mPa ris onof the effe etsof diffe r enteom Poun dsliPo s om e s was de s e ribed W ecome tothe c onclusion that H 一 Ph a s e 15 not the on ly souree wh