微生物碳氮磷测定.doc

土壤微生物量碳氮磷测定方法1、 试剂配制微生物量碳试剂：1 硫酸钾溶液c(K2SO4)=0.5molL-1：称取硫酸钾（K2SO4，化学纯）87.10g，先溶于300ml去离子水中，加热，转移溶液至容器中，再加少量去离子水溶解余下的部分，转移溶液至同一容器中，如此反复多次。最后定容至1L；（需大量配制）2 生物量C氧化剂：1.2800g在130下烘干两个小时的K2Cr2O7与400mlH2O，2L的优级纯浓硫酸混合，配成2.4L的混合氧化剂溶液，在室温，棕色瓶中保存；3 葡萄糖标准储备液（100mg/L）：准确称取0.2502g的无水葡萄糖溶于1000mL的容量瓶中，存放在4冰箱，使用时稀释为所需标准溶液；微生物量氮试剂：4 醋酸锂溶液：称取氢氧化锂(LiOHH2O)168g，加入冰乙酸(优级纯)279mL，加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50的氢氧化钠溶液调节pH 至5.2；5 茚三酮试剂：23g分析纯水合茚三酮溶解于750ml二甲基亚砜，加入250ml醋酸锂缓冲液，混合30min，使氧气和氮气排出；（注意此试剂在使用前一天配置，室温下密封保存）6 氢氧化钠溶液（10mol/L）：400g分析纯氢氧化钠溶于去离子水，稀释至1L；7 柠檬酸缓冲液：42.0g分析纯柠檬酸和16.0g氢氧化钠，溶于900ml去离子水，用10mol/L氢氧化钠调节Ph至5.0，再用水稀释至1L；8 乙醇溶液：95%分析纯乙醇与去离子水按体积比1：1比例混合；9 1mg/ml的硫酸铵标准储存液：称取4.7167g分析纯硫酸铵(称前105烘2h)溶于0.5moL/L硫酸钾溶液中，并用硫酸钾溶液定容至1000mL，摇匀，于4冰箱中保存。10 0.1mg/ml的硫酸铵(NH4)2SO4标准液：吸取10mL1mol/L的硫酸铵标准储存液于100mL容量瓶中，用0.5mol/L硫酸钾溶液定容至100mL摇匀。此溶液最好现配现用。11 工作曲线的制备：分别吸取0.00mL、0 .50mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL 0.1mg/ml的硫酸铵标准液于1000mL容量瓶中,用0.5moLL硫酸钾溶液定容至100mL，摇匀。然后取1.5ml，按照样液的步骤进行显色和比色。微生物量磷试剂：12 1mol L-1 HCl溶液：用8.33 mL的浓盐酸用蒸馏水定容至100 mL。13 碳酸氢钠浸提液 c（NaHCO3）= 0.5mol L-1，pH 8.5：42.0g分析纯碳酸氢钠溶于800ml蒸馏水，用1mol L-1 NaOH溶液缓慢调节pH至8.5，再用蒸馏水定容至1L。注意该浸提液放置时期过长时，因CO2释放使溶液pH升高。14 硫酸溶液c（H2SO4）= 2.5mol L-1：70.0ml分析纯浓硫酸（H2SO4，= 1.89g ml-1），用蒸馏水稀释定容至500ml。14 钼酸铵溶液（4%）：20.0g分析纯钼酸铵溶于蒸馏水，定容至500ml。16 抗坏血酸溶液c（C6H8O6）= 0.1mol L-1：1.32g抗坏血酸溶于75ml蒸馏水。抗坏血酸溶液极易被氧化，应在使用时当天配制。如需保存可于75ml此溶液中加入25mg乙烯二胺四烷基醋酸二钠和0.5ml蚁酸使其稳定。17 酒石酸锑钾溶液（Sb）= 1mg ml-1：0.2743g分析纯酒石酸锑钾溶于蒸馏水，定容至100ml。18 混合显色液：取上述125ml硫酸溶液与37.5ml钼酸铵溶液混合，再加入75ml抗坏血酸溶液和12.5ml酒石酸锑钾溶液，混匀。此溶液保存时间不宜超过24h。19 标准磷酸二氢钾溶液（KH2PO4）= 4g P ml-1：0.1757g分析纯磷酸二氢钾（称量前先经105烘23h），溶于少量蒸馏水，再加入少量硫酸，用蒸馏水定容至1L，即为40g P ml-1磷贮存液，置4下保存。取50ml贮存液稀释至500ml，即得到浓度为4g P ml-1磷溶液，此溶液不宜久存。二、样液制作1 土壤灭菌（1）土壤混合均匀后过2mm筛，除去根、秸秆、石头等杂质，烘干法测定土壤样品含水量，以及土壤田间饱和持水量（一般是土壤质量的30%）；（2）调节土壤含水量到田间饱和持水量的80%（水稻土适当冷冻干燥）左右。一般调节土壤含水量到25%；（3）每个样品称取相当于10克干土的土壤样品于100毫升塑料瓶中 。（或称10克样品后根据含水量换算）；（4）塑料瓶盖上盖（注意盖上要钻孔以防止微波炉加热样品时爆炸），放入微波炉加热；（5）加热量：每1克土800焦耳热量。即为：每1克土应在功率为800W的微波炉加热1秒。每个样品10克土，则为10秒。若有10个样品（100克土），加热100秒。依次类推，注意样品不能太多。微波炉1层较适宜；（6）在加热时间到一半时，从微波炉中拿出样品来均匀搅拌后再继续加热，杀灭效果更好。2 浸提微生物量碳氮：将灭菌和未灭菌的两批土样每瓶加入40ml 0.5M K2SO4溶液（土水比为1:4），盖紧瓶塞，振荡30分钟（25），用慢速定量滤纸过滤到150ml大三角瓶中，应立即测定。如不立即测定，用保鲜膜封口（防止污染和挥发），保存在-20的冰箱。同时做不加土壤的空白对照。微生物量磷： 将灭菌与不灭菌土壤完全无损地转入250ml塑料浸提瓶中，加入200ml 0.5mol L-1 NaHCO3浸提液（土水比为1 : 20，w : v），充分振荡浸提30min，用慢速定量滤纸过滤。如果滤液浑浊，应使用双层滤纸，或先离心再过滤。浸提液应立即测定或在18下保存。做不加土壤的空白对照。3、 分析测定1 微生物量碳测定（1）吸取土壤灭菌浸提液1.6ml于50ml锥形瓶中，再加入2.4ml的生物量C氧化剂，摇匀；（2）将锥形瓶放置在140的消煮炉上维持30min（待温度达到140后开始计时），冷却后用1cm石英比色皿在350nm波长下进行比色，读取吸光值A。同时测定不灭菌土壤浸提液，3次重复；（3）工作曲线：用葡萄糖储备液分别稀释成含碳量为0，10，20，30，40和50mgCL-1的标准溶液，然后分别吸取1.6ml加入硬质玻璃管中，在加入2.4ml的生物量C氧化剂后，摇匀与样品一起在消煮炉中进行消煮，在350nm条件下进行比色。以A值为纵坐标，碳的浓度为横坐标绘制工作曲线，根据样品A值查得测定溶液中碳的浓度。2 微生物氮测定（1）取1.5ml浸提液和标准曲线溶液于40ml硬质试管中，加入3.5ml柠檬酸缓冲液，使浸提液中的硫酸钙和硫酸钾彻底溶解，再缓慢加入2.5ml茚三酮试剂，彻底混匀；（2）将试管置于沸水浴中加热25min（放入试管2min后水浴应再次沸腾），使加入试剂时产生的沉淀彻底溶解；（3）待溶液冷却至室温，加入9.0ml乙醇溶液，混匀，于570nm波长下比色。3 微生物量磷测定（1） 取适量的浸提液（1.55ml）于20ml比色管中，加入适量的1mol L-1 HCl溶液进行中和，HCl溶液的加入量通常为浸提液体积的1/2；（2） 放置4h并间隙摇动以排除CO2。补充蒸馏水至约10ml，加入4ml混合显色液，再加蒸馏水定容，完全显色后在882nm波长处比色。（3） 工作曲线：分别取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0ml 4g P ml-1标准磷溶液于20 ml比色管中，加入与样液等量的NaHCO3浸提剂，同上进行显色和比色，得到浓度为0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8g P ml-1标准磷工作曲线。4、 结果计算1 微生物生物量碳的计算(C)=Ec/KEc式中：(C)微生物生物量碳（Bc）质量分数，mgkg-1；Ec灭菌土样有机碳与未灭菌土样有机碳之差，mgkg-1；KEc氯仿灭菌杀死的微生物体中的碳（C）被浸提出来的比例，一般取0.332 微生物生物量氮的计算BN=m