3.实验三-DNA的琼脂糖凝胶电泳1.ppt

1 实验三DNA的琼脂糖凝胶电泳 分子生物学实验 2 一实验目的 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 自从琼脂糖 agarose 和聚丙烯酰胺 polyacrylamide 凝胶被引入核酸研究以来 按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术 已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段 也是现在通用的许多分子生物学研究方法 如 DNA分型 DNA核苷酸序列分析 限制性内切酶片段分析以及限制酶切作图等的技术基础 受到科学界的高度重视 3 二实验原理 DNA在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应 核酸为两性分子 在pH3 5时 整个分子带正电 pH8左右时 整个分子带负电 在碱性环境下 核酸分子之糖 磷酸骨架中的磷酸基团是呈离子化状态的 把这些核酸分子放置在电场当中 它们就会向正电极的方向迁移 由于糖 磷酸骨架在结构上的重复性质 相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷 因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移 在一定的电场强度下 DNA分子的这种迁移速度 亦即电泳的迁移率 取决于核酸分子本身的大小和构型 DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系 可以近似用于估算分子的大小 可以分离相对分子质量相同 但构型不同的DNA分子 共价闭环超螺旋DNA 直线DNA 开环的双链环状DNA 4 二实验原理 5 凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关 凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小 浓度越高 孔隙越小 其分辨能力就越强 反之 浓度降低 孔隙就增大 其分辨能力也就随之减弱 6 DNA分子的大小 琼脂糖凝胶的浓度 DNA的构象 所加电压 电场方向 嵌入染料的存在 电泳缓冲液的组成 琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0 2 50kb之间 7 EB 溴化乙锭 能插入DNA分子碱基对之间 导致EB与DNA结合 DNA吸收的260nm的紫外光传递给EB 或者结合的EB本身在300和360吸收的射线 均可在可见光区以590波长发射出来 呈橙红色 电泳时所需DNA样品量仅0 5 1 g EB染料优点 染色操作简便 快速 室温下15 20min 不会使核酸断裂 灵敏度高 10ng或更少的DNA即可检出 可以加到样品中或胶中 EB是诱变剂 使用时一定要戴手套 EB废液要经过处理才能丢弃 在紫外线的照射下结合溴化乙锭的DNA分子发出荧光 8 三实验步骤 称样 溶解 加热 制板 倒胶 取样 点样 电泳 检测 9 三实验步骤 制胶 1 0 琼脂糖凝胶 50ml 凝胶板的制备 小心加入2 3 lEB 摇匀 污染EB吸头 不宜再回收使用 点样 样品20 l 与4 l溴酚兰混匀 DNAmaker3 l加入10 l水与4 l溴酚兰混匀 电泳 稳压80v DNA向阳极移动 大约50 60min 观察和拍照 254nm紫外灯下观察 10 四实验结果 五注意事项 EB是一种诱变剂 操作时必须戴塑料或乳胶手套 六习题 琼脂糖凝胶电泳的适用范围 2 影响琼脂糖凝胶电泳的因素有哪些 4泳道maker1泳道质粒DNA2 3 5 6泳道酶切产物 123456