耐药基因型检测.doc

作业指导书第1页 共4页文件编码：第1版 第0次修改文件名称：耐药基因型检测操作规程作业指导书颁布日期 2007年01月07日耐药基因型检测操作规程作业指导书1 目的本操作规程是关于使用in-house方法进行耐药性检测过程标准操作和结果分析保存的规程。2 适用范围适用于HIV-1耐药基因型测定。3 职责在使用in-house方法进行耐药性检测过程中，研究人员必须依照本标准操作规程进行操作。4 作业程序4.1 核酸提取：推荐使用QIAGEN公司QIAamp Viral RNA Mini Kit 提取RNA。4.2 引物4.2.1 扩增引物第一轮 PCR：外侧上游引物MAW 26 ：5-TTGGAAATGTGGAAAGGAAGGAC-3; HXB2 2028-2050 外侧下游引物RT21 ：5-CTGTATTTCTGCTATTAAGTCTTTTGATGGG-3; HXB2 3509-3539第二轮 PCR： 内侧上游引物 PRO-1 ：5-CAGAGCCAACAGCCCCACCA-3; HXB2 2147-2166 内侧下游引物 RT20 ：5-CTGCCAGTTCTAGCTCTGCTTC-3; HXB2 3441-3462 4.2.2 测序引物正向测序引物：PROS3 ：5-GCCAACAGCCCCACCA-3RTAS ：5-CTCAGATTGGTTGCAC-3RTBS ：5-CCTAGTATAAACAATGAGACAC-3; HXB2 2946-2967反向测序引物：PROC1S ：5-GCTGGGTGTGGTATTCC-3RT20S3 ：5-GTTCTAGCTCTGCTTC-3 参照国际标准株HXB2株（全基因1-9719bp）POL基因序列(2253-5096bp)，其中蛋白酶(2253-2549bp)，逆转录酶基因(2250-4229bp)，整合酶基因(4230-5096bp)。我们所使用的方法扩增产物长度为1.3kb，包括蛋白酶基因全长（1-99 codon）和逆转录酶基因前300个氨基酸(1-300 codon)。4.3 准备RT-PCR（逆转录及第一轮PCR）反应体系：在PCR准备间安全柜内进行，注意配置过程应在冰上进行。推荐使用Takara One Step RNA PCR Kit(AMV)，总体系25l，见下表： 反应数1410162410*buffer2.510254060MgCl25205080120dNTP2.510254060MAW260.525812RT210.525812RT0.525812taq 0.525812RNase Inhibitor0.525812ddH2O7.53075120180template54.3.1将除酶以外的试剂取出置于室温，待其溶化后震荡混匀5秒钟，短暂离心后置于冰上备用。4.3.2酶及逆转录酶抑制剂取出置于冰上，使用后立即放回-20保存。4.3.3准备PCR管，管身标记清楚编号，置于冰上备用。4.2.4使用1.5ml离心管配制RT-PCR反应体系（单位 l），按每管20l将配制好的反应体系分装至PCR管中，注意将液体加至管底。4.4 RT-PCR（逆转录及第一轮PCR）4.4.1将分装好的PCR管拿到加样间，分别将样本RNA、阳性对照样本RNA及阴性对照样本RNA各5l加入相应PCR管中。注意不要发生交叉污染。4.42 将混合物混匀并短暂离心后放入PCR仪中，设定程序：50 30分钟；94 5分钟；94 30秒 ，55 30秒，72 2分30秒，30 cycles；72 10分钟，4 保温。运行程序。4.5 第二轮PCR4.5.1 在PCR准备区配制反应体系，注意配置过程应在冰上进行。推荐使用TakaraPerfectshot TM Ex Taq Mix，总体系50l，见下表： 反应数14101624Mix25100250400600PRO-114101624RT2014101624ddH2O1872180288432template54.5.2 反应体系的配制同RT-PCR。体系配制完成后，按照每管 45l将配制好的反应体系分装到PCR管中。4.5.3将分装好的PCR管拿到加样间，将第一轮反应产物各5l加入相应的PCR管中，将混合物混匀并短暂离心后放入PCR仪，设定反应程序： 94 5分钟；94 30秒，63 30秒，72 2分钟30秒，30 cycles；72 10分钟,4 保温。运行程序。4.6 PCR扩增产物电泳鉴定4.6.1于三角烧瓶中称取1g琼脂糖，加入100ml 1TAE溶液,配成1%的胶溶液，置于微波炉中，中火加热3分钟，冷却到60左右时加入5ul 1%的EB溶液混匀。4.6.2洗净的电泳板和梳子擦干，倒入溶胶液，使胶的厚度达到0.5cm左右。室温下放置至少40分钟以上,使胶彻底凝固。4.6.3待胶凝好后缓慢拔出梳子，放入电泳槽，倒入1TAE，使液面高出胶平面1mm左右。4.6.4取第二轮PCR产物5ul缓慢加入电泳孔中。（若反应体系中不含Loading Buffer则于玻璃纸上滴点10上样缓冲液，每滴约1ul，取第二轮PCR产物5ul 与10上样 缓冲液液滴混匀后缓慢加入电泳孔中。）同时在电泳孔中加入5 ul分子量为2000的Marker，判断PCR扩增产物的正确位置。4.6.5电泳仪电压设量为100v，恒压电泳，40分钟左右观察结果。4.6.6将电泳后的胶从胶板上取下，置于紫外透射反射仪上观察电泳胶中期望的PCR产物条带并拍照。4.6.7挑取PCR阳性样本用于扩增产物的纯化回收，同时应该暂时保存第一轮PCR产物（-20C）以备必要时进行再次扩增。4.7 PCR扩增产物纯化 此步骤用于将PCR产物纯化并回收，用于回收的样品应经电泳检测无明显拖尾，并且有足够的浓度，回收的样品DNA也应符合无明显拖尾、杂带的标准才可用于测序。4.7.1方法如上配置2%的琼脂糖凝胶 ,使胶的厚度达到1cm左右.室温下放置至少40分钟以上, 待胶彻底凝固后将剩余45ul PCR产物全部加入电泳孔中。（于剩余45ul PCR产物的PCR管中加入10上样缓冲液5ul, 混匀后将第二轮PCR产物全部加入电泳孔中。）4.7.2 PCR产物2%琼脂糖凝胶电泳, 恒压100v 1小时（具体电泳时间以将目的条带和其它混杂条带分开为准）。4.7.3 用干净的手术刀将含有PCR产物的琼脂糖凝胶切下置于1.5mlPCR管中，胶块重量控制 在0.1克左右。注意在切胶时应在胶下铺一层PE手套，以防止刀片损坏紫外灯。4.7.4 称量胶块的重量，然后依据QIAquick Gel Extraction试剂盒操作说明进行纯化。4.8 测序 4.9 序列结果贴网分析(Stanford HIV Drug Resistance Database使用规程)4.9.1 直接进入Stanford Hiv Drug Resistance Database()，图1。点击HIVdb，进入下一界面（图2）。图1 图2 4.9.2 点击左上角Analyze a sequence，进入下一界面（图3）。图34.9.3 点击Choose a file to upload from your computer using the file selection box below标题下的浏览框选择所要分析的序列所在文件夹，选中文件名，点击打开或者将测序好的序列（文本格式）粘贴在此界面下方text box里，点击Analyze 进入下一界面（图4）。 图4在此界面会出现一个表格，表明是Sequence Quality Assessment，上表对所测得序列PR基因包含1-99个密码子和RT基因包含1-248个密码子的序列进行三个方面的质量评估： Stop Codons（终止密码子）和Frame Shifts（移码突变）； B,D,H,V,N:：如果产生在耐药位点，用GCG 软件包或Bioedit软件进行序列比对分析，对照测序胶图比较是否在此位点出现重叠峰，这有可能是体内野生株和突变株共存； Unusual Residues（非正常碱基）。4.9.4 续上图（图5），此界面显示一个PI Drug resistance interpretation和PR Comments。此界面说明了产生的针对蛋白酶抑制剂相关耐药位点和耐药的程度。例如：该序列分析结果说明这个病人接受了抗蛋白酶抑制剂（PI）的治疗，产生蛋白酶抑制剂主要耐药突变（PI Major Resistance Mutations），有三个突变位点，分别是I54V、V82A 和 L90M。产生蛋白酶抑制剂次要耐药突变（PI Minor Resistance Mutations），有五个突变位点，分别是L10I、D60E、L63P、A71V、I93L。图54.9.5 续上图（图6），此界面显示一个NRTI and NNRTI Drug resistance interpretation和RT Comments. 此界面说明了产生的针对逆转录酶抑制剂相关耐药位点和耐药的程度。例如，序列分析结果说明这个病人同时也接受了抗逆转录酶抑制剂的治疗，产生核苷类逆转录酶抑制剂的耐药突变（NRTI Resistance Mutations），有四个突变位点，分别是D67N、K70R、T215F、K219Q。未产生非核苷类逆转录酶抑制剂的耐药突变（NNRTI Resistance Mutations）。图64.9.6 续上图（图7），此表显示一个Mutation Scoring, 它主要根据耐药突变位点得到关于每个药物的一个分值，分值累积得到这种药物的Total Scoreing，按照总分值来判断耐药的程度。图74.9.7 五种类型耐药突变判断标准：4.9.7 .1 Susceptible (score 0-9): virus isolates of this type have not shown reduced susceptibility to the drug 4.9.7 .2 Potential low-level resistance (score 10-14): virus isolates of this type have mutations which by themselves may not cause drug resistance, yet indicate the possibility of previous drug selection. 4.9.7 .3 Low-level resistance (score 15-29): virus isolates of this type have reduced in vitro susceptibility to the drug and/or patients with viruses of this genotype may have a suboptimal virologic response to treatment 4.9.7 .4 Intermediate resistance (score 30-59): the genotype suggests a degree of drug resistance greater than low-level resistance but lower than high-level resistance 4.9.7 .5 High-level resistance (score 60): the genotype is similar to that of isolates with the highest levels of in vitro drug resistance and/or patients infected with isolates having similar genotypes generally have little or no virologic response to treatment 五、实验室数据汇总各实验室将测得数据整理成下表形式，汇总至国家CDC性艾中心，性艾中心将根据全国调查结果，撰写一份综合报告，并将报告发