《胶原样凝集素》PPT课件.ppt

胶原样凝集素COLLECTIN 郑州大学医学院免疫学与微生物学教研室李付广 一 凝集素 LECTIN 的分类C 型凝集素 需要Ca2 维持活性的凝集素S 型凝集素 巯基依赖或 半乳糖结合的凝集素 二 胶原样凝集素历史上的重要发现 1906conglutinin firstanimallectintobeassociatedwiththeimmunesystem1989 1991mannan bindinglectin1999collectinliver1 CL L1 2001collectinplacenta1 CL P1 2003collectinkidney1 CL K1 三 胶原样凝集素的一般特性 四 胶原样凝集素的结构 一 一级结构特点1 N端富含半胱氨酸区段 7 28氨基酸 其中1 3半胱氨酸2 胶原样区 53 177氨基酸 Gly Xaa Yaa n重复序列 Xaa Yaa多为脯aa或羟脯aa3 颈区 24 28氨基酸 helicecoiled coils4 糖识别区 CRDs 与相应的糖配体结合 二 三级结构 1 同源三聚体的形成 亚单位 相同的三条肽链形成类似郁金香花朵2 亚单位进一步聚集成寡聚体单体 CL 43 CL L1四聚体 SP D Conglutinin CL 46 十字形结构 六聚体 SP A MBL 一束郁金香花 三 糖结合特异性 胶原样凝集素的凝集素样活性存在于CRDs 由三个氨基酸基序决定 1 甘露糖结合基序 Glu Pro Asn2 半乳糖结合基序 Gln Pro Asp所有胶原凝样集素 SP A除外 均具有甘露糖特异基序Glu Pro Asn SP A第三位的氨基酸由Arg 狗 或Ala替换Asn 系统树 五 结合微生物种类 五 胶原样凝集素在宿主防御方面的生物学功能 一 凝集作用通过桥联 可使病原微生物凝集成大块 加强呼吸道黏膜纤毛清除作用 阻止病原吸附到细胞表面 抑制其定居和侵入 促进吞噬作用 二 补体激活作用1 MBL产生病原微生物感染早期刺激激活巨噬细胞和中性粒细胞TNF IL 1 IL 6急性期反应肝细胞MBL CRP2 MBL途径 lectinpathway MBL与病原微生物表面的mannose fucose GlcNAc结合启动的补体激活级联反应 三 调理作用1 collectin的受体见下表2 collectin直接作为调理素3 激活补体成分C4b C3b iC3b4 吞噬作用的激活 四 抑制微生物的生长SP A SP D直接引起微生物细胞壁通透性增强 导致微生物生长抑制或死亡 五 调节炎症反应调节前炎症因子的合成分泌 六 调节特异性免疫DCs抗原提呈 DCs成熟 T细胞增殖 七 调节过敏反应SP A SP D抑制IgE与过敏原结合 抑制过敏早期组织胺释放 抑制晚期支气管炎症中淋巴细胞增殖 八 对细胞凋亡的影响SP A抑制 型肺泡细胞凋亡 SP A SP D MBL刺激凋亡细胞清除 HumanCL L1的研究 1999年Ohtanik 等克隆和鉴定出一个编码新的胶原凝集素基因 称肝脏胶原凝集素1 collectinliver1 CL L1 该基因定位于第八号染色体的长臂上 其基因结构由6个外显子 EX1 EX6 和5个内含子 IN1 IN5 组成 cDNA含有831bp插入片段 编码277个氨基酸残基 推测的氨基酸序列具有典型的胶原凝集素结构 N端富含半胱氨酸区 胶原样区 颈部和糖识别区 CL L1与其他胶原凝集素相比 具有独特之处 MBL SP A和SP D基因定位于第10号染色体 而CL L1基因定位于第8号染色体 C末端具有4个重复的赖氨酸结构 CRD和颈区由一个外显子编码 胶原样区有5个外显子编码 胶原凝集素绝大多数为分泌型 存在于体液和分泌液中 只有CL L1为可溶性胞浆内蛋白 因此推测CL L1可能具有独特的功能 Comparisonofthreeconstructs Neck CRD kkkk M1234 25kDa 17kDa Mmarker1beforeinductioninduction1hrinduction3hrsinduction5hrs GrowthofstandardE coliexpressionculture 200ml 1 Inoculate20mlofSOB containingampicillin100 g ml chloramphenicol35 g ml in100mlflask Growtheculturesovernightat37 C 2 Inoculate200mlofprewarmedSOBmediawith10mloftheovernightculturesandgrowat37 CwithvigorousshakinguntilanOD600of0 6isreached 3 Takea1mlsampleimmediatelybeforeinduction 4 InduceexpressionbyaddingIPTGtoafinalconcentration1mM 5 Incubatetheculturesfor3hrs Collectasecond1mlsample 6 Harvestthecellsbycentrifugationat3500rpmfor25min 7 Freezethecellsat 70 PreparationofclearedE colilysateunderdenaturingconditions 1 Thawthecellpelletfor15minoniceandresuspendinlysisbufferat5mlpergramwetweight 2 Stircellsfor15 60minatroomtemperature 3 Centrifugelysateat10000 gfor20 30minatroomtemperaturetopelletthecellulardebris Savesupernatant andfilterthesupernatantwith0 45 mfilter 4 Add10 l2 SDS PAGEsamplebufferto10 lsupernatantandstoreat 20 CforSDS PAGEanalysis PurificationofNeck CRD KKKKofhCL L1withNi NTAcolumn 1 Equilibratecolumnwith5columnvolumesoflysisbuffer 2 Applylysatetocolumn Collectthepass throughforSDS PAGEanalysis recycleonce 3 Washwith10columnvolumesofwashbufferuntilA280isbelow0 01 4 Eluteproteinwithelutionbuffer Collectthesingleproteinpeakcompletely Dialysisofrecombinantprotein buffer1 8MureaTBS pH7 6 300ml buffer2 TBS pH7 6 3000ml 1 Addelutionintomembranetube MWCO15000 putthemembranein300mlbuffer1 stirringslowly 2 Add100mlbuffer2at6hourintervals total8times 3 Atlastputmembranein2000mlbuffer2fordialysisovern