空肠弯曲杆菌分子生物学鉴定.ppt

空肠弯曲杆菌分子生物学检测方法研究进展 一 空肠弯曲杆菌简介二 DNA环介导恒温扩增法三 DNA环介导恒温扩增法检测空肠弯曲杆菌四 研究意义五 前人研究进展六 拟解决的关键问题 一 空肠弯曲杆菌简介 空肠弯曲杆菌 Campylobacterjejuni C jejuni 作为一种食源性人畜共患病的病原体 越来越受到国内外高度重视 近年来 空肠弯曲杆菌感染率在世界各地普遍呈上升趋势 空肠弯曲杆菌系弯曲杆菌属的一个种 弯曲杆菌属细菌分为两类 一类是25 生长 42 不生长的细菌 另一类为25 不生长 42 生长的细菌 空肠弯曲杆菌在弯曲杆菌属中最为常见 是引起人类细菌性胃肠炎的主要病原菌之一 空肠弯曲杆菌为多形性 呈弧形 螺旋形 海鸥展翅形或S形 革兰氏染色阴性 空肠弯曲杆菌在外环境下的存活力取决于温度 4 时在水 粪便 尿 牛奶中可存活几周 25 时只能存活几天或更短的时间 对热敏感 58 经过5分钟即可杀灭 另外阳光直射及消毒剂也有很好的杀灭效果 空肠弯曲杆菌为微需氧菌 在大气或厌氧的环境中不能生长 空肠弯曲杆菌作为共生菌大量存在于各种野生或家养动物的肠道内 与人体感染较为密切的主要为家畜和家禽 家禽已从鸡 鸭 鹅 火鸡等家禽的粪便 胆汁 泄殖腔内容物中分离到该菌 感染率高 带菌期长 可长达18个月 分子生物学检测方法常规生化检测方法血清学方法PCR方法 定性PCR方法荧光定量PCR方法 环介导恒温扩增法 二 DNA环介导恒温扩增法 DNA环介导恒温扩增 LAMP 反应 是分子生物学领域中的一个新概念 它可以在恒温 60 65 条件下 30 60min内将只有几个拷贝的靶核酸扩增到10 水平该方法的一大特色是 可以通过反应副产物 白色焦磷酸镁沉淀的产生与否判断靶基因的存在 DNA环介导恒温扩增用于病原微生物 如空肠弯曲杆菌 的鉴定具有高效率 高特异性 高敏感性等特点 LAMP方法在食品安全检测 流行性病毒检测 临床诊断等领域的应用及研究均有文献报道 LAMP方法已具有成功应用的现实性 为快速基因的检测提供了一种新的技术途径 比PCR方法更具推广性 可望作为常规检测的工具 2000年 Notomi等开发出一种新的DNA环介导的恒温扩增法 loop mediatedisothermalamplificationofDNA LAMP LAMP方法利用Bst大片段DNA聚合酶和根据不同靶序列设计的两对特殊的内引物 FIP由F1C和F2组成 BIP由BIC和B2组成 外引物 F3和B3 特异地识别靶序列上的6个独立区域 FIP引物的F2序列与靶DNA上互补序列配对 启动循环链置换反应 F3引物与模板上的F3C区域互补 引起合成与模板DNA互补的双链 从而挤掉FIP引起的DNA单链 与此同时 BIP引物与被挤掉的这条单链杂交结合 形成的环状结构被打开 接着 B3引物在BIP外侧进行碱基配对 在聚合酶的作用下形成新的互补链 被置换的单链DNA两端均存在互补序列 从而发生自我碱基配对 形成类似哑铃状的DNA结构 LAMP反应以此DNA结构为起始结构 进行再循环和延伸 靶DNA序列大量交替重复产生 形成的扩增产物是有许多环的花椰菜形状的茎 环结构的DNA 数量级可达10 DNA环介导恒温扩增反应原理示意图 LAMP方法特点扩增反应易进行和扩增产物方便 快捷鉴别LAMP反应特异性强 灵敏度高实验装置简单 三 DNA环介导恒温扩增法检测空肠弯曲杆菌 拟建立一种DNA环介导恒温扩增法来检测空肠弯曲杆菌与PCR扩增方法类似 根据反应的副产物是白色焦磷酸镁沉淀 可肉眼观察 来鉴定反应是否进行 LAMP扩增产物可以像PCR反应一样利用凝胶电泳并结合成像系统进行检测 利用LAMP方法检测空肠弯曲杆菌 不仅可以对反应结果进行定性 而且还可以通过利用焦磷酸镁沉淀的产生量与DNA的生成量之间的线性关系 对反应的DNA进行定量 四 研究意义 预防和控制空肠弯曲杆菌病在我国的流行 不但具有重要的经济意义 更重要的是将在我国社会发展中起重要作用 具有重大的社会意义 只有对空肠弯曲杆菌流行分布状况进行全面系统地调查研究 搞清其感染率和发病率 掌握其耐药谱 才能准确地预测其流行趋势 空肠弯曲杆菌广泛存在于动物机体 很容易对集约化养殖中普遍应用的抗菌药物产生耐药性 且这种耐药性很容易通过食物等途径转移给人类 直接威胁人类健康 因此对空肠弯曲杆菌的检测具有重要的公共卫生学意义 五 前人研究进展 一般对空肠弯曲杆菌的检测大多采用PCR方法 利用DNA环介导恒温扩增法检测了如金黄色葡萄球菌 沙门氏菌 志贺杆菌 李斯特菌等 前人均有文献报道 王福厚等人用环介导恒温扩增 LAMP 检测沙门氏菌的研究表明 LAMP方法特异性好 最佳反应温度为63 沙门氏菌的检测灵敏度为7 8cfu mL LAMP方法检测沙门氏菌特异性强 灵敏度高 时间短且操作简便 有望成为快速检测沙门氏菌的新方法 李永刚等人用环介导恒温扩增法 LAMP 检测金黄色葡萄球菌的研究表明 LAMP方法特异性好 最佳反应温度为61 灵敏度高 金黄色葡萄球菌的检测灵敏度为8 9cfu mL 蒋亚男等人用环介导恒温扩增方法快速检测乳中单增李斯特菌的研究表明 LAMP检测单增李斯特菌的特异性强 检出限高 其灵敏度比普通PCR高10倍 并且检测时