酶联免疫吸附试验ELISA-2.ppt

实验五1 酶联免疫吸附试验 ELISA 2 补体结合反应 1 酶联免疫吸附试验 ELISA 免疫标记技术 定义 将抗原 抗体反应与标记技术相结合 用放射性同位素 酶或荧光素标记的已知抗体或抗原 通过检测标记物 间接测定未知的抗原或抗体 分类 放射免疫测定法 131I 32P免疫荧光技术 FITC PE免疫酶测定法 HRP AP 免疫酶测定法 EnzymeImmunoAssay EIA 用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应 辣根过氧化物酶 HRP 碱性磷酸酶 AP 特点 高度特异性 保持抗原抗体反应的特异性高灵敏度 酶催化底物显色的高效性 pg水平微量检测定性定量检测 反应液颜色深浅或光密度值分类 酶联免疫吸附试验 可溶性抗原或抗体酶免疫组化法 组织中或细胞表面的抗原 酶联免疫吸附试验 Enzyme LinkedImmunoSorbentAssay ELISA 用酶标记抗原或抗体检测液体 血液 细胞液 中未知抗体或抗原的方法 1 定义 2 分类 间接法 IndirectELISA 将已知抗原吸附于固相载体 酶标记二抗检测液相中未知抗体双抗体夹心法 SandwichELISA 将已知抗体吸附于固相载体 酶标记一抗检测液相中的可溶性抗原竞争法 CompetitiveELISA 将已知抗体或抗原吸附于固相载体 酶标记抗原或抗体检测液相中的可溶性抗原或抗体 酶联免疫吸附试验 Enzyme LinkedImmunoSorbentAssay ELISA 3 原理 以间接性ELISA为例 显色 实验内容 间接法测定溶血素 定性检测 实验材料 脱纤维绵羊红细胞 抗原兔抗绵羊红细胞抗体 溶血素 待测兔血清HRP标记羊抗兔IgG 二抗包被缓冲液 0 05MpH9 6碳酸盐缓冲液洗涤液 含0 05 Tween20的0 01MpH7 4PBS底物缓冲液 pH5 0磷酸盐柠檬酸缓冲液底物溶液 OPD10mg 底物缓冲液25ml 30 H2O240 L酶标板 酶标仪 实验方法 1 抗原的处理 脱纤维绵羊血 加3mLN S 混匀 2000rpm 5min 加3mLN S 混匀 2000rpm 5min 取2mL压积红细胞 加入2mL蒸馏水 震荡破碎红细胞 用包被缓冲液稀释成1 400备用 2 包被抗原 取酶标板 加入100 L 孔的抗原稀释液 4 湿盒内 18h 取出包被好抗原的酶标板 4孔 组 甩干孔内液体 以洗涤液 200 L 孔 洗涤3次 3min 次 3 加待测血清 标记各孔 加入相应液体100 L 孔 1 2 3 4 阴性 空白 阳性 待测 4 加二抗 37 湿盒内 30min 甩干孔内液体 以洗涤液 200 L 孔 洗涤3次 3min 次 各孔加入酶标二抗100 L 孔 37 湿盒内 30min 5 显色 甩干孔内液体 以洗涤液 200 L 孔 洗涤3次 3min 次 加入底物溶液100 L 孔 避光显色 10min 6 观察结果 实验方法 预期结果 阳性 显色为黄色阴性 无色 1234 阴性 阴性 阳性 阳性 注意事项 洗涤彻底 避免交叉污染 按顺序加样 孔底无气泡 包被和温育在湿盒内进行 2 补体结合反应 ComplementfixationTest CFT 概念 补体结合反应 是指在补体的参与下 以绵羊红细胞 SRBC 和溶血素 抗SRBC的抗体 作为指示系统的抗原抗体反应 补反中包括两个系统五种成分 待检系统 已知Ag或Ab 待检Ab或Ag及仅供一组Ag Ab系统反应的定量补体 指示系统 绵羊红细胞和溶血素 原理 待测系统抗原 未知血清 补体 1 2 Step1抗原抗体复合物的形成 Step2补体的结合和耗竭 指示系统SRBC 抗SRBC抗体 Step3SRBC的裂解 1 2 1 NoAb 2 Ab Ag Y Ab阳性 NoAb阴性 Ag Ag Ag 抗原 伤寒菌裂解产物待测血清 56 30min补体 豚鼠血清2 绵羊红细胞溶血素 材料 方法 1 2 3 4 5 试验管 血清对照管 抗原对照管 补体对照管 SRBC对照管 待测血清 0 2mL 0 2mL 0 2mL 0 2mL 0 2mL 0 2mL 0 2mL 0 2mL 0 2mL 0 2mL 0 4mL 0 8mL 抗原 补体 N S 摇匀 37 水浴15min 溶血素 SRBC 0 2mL 0 2mL 0 2mL 0 2mL 0 2mL 0 2mL 0 2mL 0 2mL 0 2mL 摇匀