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第二章酶的发酵工程 所有的生物为了维持其正常的生命活动 在一定的条件下都能够合成其自身生长所需要的各种酶 酶的种类和数量是受到细胞自身的严格调控的 通过人为的操作控制 利用生物细胞的生命活动来大规模发酵生产人们所需要的酶的技术过程 称为酶的发酵生产 酶的制备方法 提取法 发酵法 合成法 第一节酶生物合成的调节机制第二节酶的发酵技术第三节酶发酵动力学 第一节酶生物合成的调节机制 一 原核生物中酶生物合成的调节 原核生物酶的合成主要是在转录水平上进行调节 调节方式主要有酶合成的诱导和酶合成的阻遏两种方式 原核生物中酶合成的诱导和阻遏作用机制都可以用Jacob和Monod提出的操纵子理论来解释 一 乳糖操纵子学说 操纵子 由调节基因 R 启动子 P 操纵基因 O 和结构基因 S 所构成的一个完整的基因表达单位 1 基本概念 诱导物 诱导酶起始合成的物质 辅阻遏物 阻遏酶产生的物质 调节蛋白 调节基因产生的一种变构蛋白 两个结合位点 操纵基因结合位点 效应物结合位点 两种类型 阻遏蛋白 阻遏蛋白原 1 乳糖操纵子的结构 I P O Z Y A 半乳糖苷酶 透过酶 乙酰基转移酶 诱导物 阻遏蛋白 cAMP CAP RNA聚合酶 2 阻遏蛋白的负性调节 3 CAP的正性调节 2 乳糖操纵子的诱导机制 DNA 二 色氨酸操纵子学说 磷酸核糖邻氨基苯甲酸 分支酸 邻氨基苯甲酸 羧苯氨基脱氧核糖磷酸 吲哚甘油磷酸 色氨酸 邻氨基苯甲酸合酶 邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶 磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶 吲哚甘油磷酸合酶 色氨酸合酶 1 操纵子的调节作用 R P O D B A C E 阻遏蛋白原 辅阻遏物 色氨酸 DNA 2 衰减子的调节作用 R P O D B A C E 低色氨酸 高色氨酸 前导序列 DNA 三 酶生物合成的诱导作用 诱导物 底物 产物 底物结构类似物 IPTG 生物学意义 节约机制 环境适应能力 四 酶生物合成的阻遏作用 1 终产物阻遏 某一代谢 合成 途径的终产物阻遏合成途径中酶的合成的现象 A B C D E E1 E2 E3 E4 2 分解代谢物的阻遏作用 当培养基中存在两种碳源 底物 时 容易利用的碳源的分解代谢产物阻遏分解代谢另一种碳源的酶的合成的现象 葡萄糖效应 葡萄糖抑制微生物利用其他碳源 底物 的现象 I P O Z Y A cAMP CAP 二 真核生物中酶生物合成的调节 一 细胞分化改变酶的生物合成 如 端粒酶的生物合成 二 基因扩增加速酶的生物合成 如 爪蟾卵细胞形成时 rRNA的基因数增加4000倍 中国田鼠细胞培养在含有氨甲基蝶呤的培养基中生长时 细胞中编码二氢叶酸还原酶的基因大量扩增 以合成大量的二氢叶酸还原酶 三 增强子促进酶的生物合成 增强子 是一段能够提高转录效率的特定DNA序列 长约100 200bp 核心组件8 12bp 单拷贝或多拷贝串联存在 增强子的作用特点 1 提高同一条DNA链上基因的转录效率 可远距离发挥作用 在基因的上游或下游均可起作用 2 与其序列的正反方向无关 3 要有启动子才能发挥作用 但对启动子没有严格的专一性 4 必须与特定的蛋白质因子结合才能发挥作用 具有组织和细胞特异性 三 酶生物合成调节作用机理的实际应用 一 发酵中的应用 二 酶生产中的应用 三 微生物菌种选育中的应用 第二节酶的发酵技术 利用微生物的发酵作用 运用一些技术手段控制发酵过程 大规模产酶的技术 称为酶的发酵技术 内容主要包括 菌种的选育 培养基的配置 培养条件控制 发酵方法 一 酶的生产菌种 一 产酶微生物的种类 1 细菌 大肠杆菌 青霉素酰化酶 L 天冬酰胺酶 枯草芽孢杆菌 中性蛋白酶 中温 淀粉酶 地衣芽孢杆菌 高温 淀粉 2 放线菌 葡萄糖异构酶 谷氨酰胺转氨酶 3 酵母菌 凝血激酶 尿激酶 植酸酶 4 霉菌 黑曲霉 米曲霉 淀粉酶 糖化酶 乳糖酶 脂肪酶 理氏木霉 木聚糖酶 纤维素酶 青霉 葡萄糖氧化酶 5 磷酸二酯酶 二 产酶菌种的要求 1 酶的产量高 2 容易培养和管理 产酶细胞容易生长繁殖 适应性强 便于管理 3 菌株遗传性能稳定 不易变异退化 不易感染噬菌体 保证生产的稳定性 4 菌株能利用廉价原料 发酵周期短 生产成本低 5 有利于酶产品的分离纯化 最好是分泌型的胞外酶 6 菌株安全可靠 非病原菌 不产毒素及其它有害物质 不影响生产人员的身体健康 7 基因工程菌必须符合安全性要求 三 菌种筛选 1 含菌样品的采集 根据不同微生物的生态分布特点 从自然界中采样 产酶微生物的分布基本规律 1 相近菌种产生的酶性质一般相近或相似 2 胞外酶的稳定性和最适条件通常和菌的最适生长条件接近 3 为获得能降解某种物质的产酶菌株 一般可从该物质分布比较丰富的地方寻找 2 菌种的分离纯化 平板划线法 稀释涂布分离法 3 产酶性能的测定 初筛 快速 简便 平板筛选法 有色圈 复筛 精确 液体或固体培养发酵 测定产酶水平 4 菌种的选育 诱变育种 杂交育种 原生质体融合育种 基因工程育种 5 菌种的保藏 斜面低温保藏法 沙土管保藏法 石蜡油封藏法 真空冷冻干燥法 超低温保藏法 固体曲法等 6 菌种的退化与复壮 1 菌种退化现象 随着菌种保藏时间的延长或多次的转接传代 菌种本身所具有的优良遗传性状发生了不利于发酵生产的遗传变异现象 2 防止退化措施 创造合适的培养条件 采取有效的菌种保藏方法 尽量减少传代次数 3 退化菌种的复壮 纯种分离和性能测定 包括已发生退化菌种的复壮和菌种退化之前的复壮和提高 四 菌种活化与扩大培养 1 菌种扩大培养 保藏菌种 试管斜面活化 三角瓶培养 种子罐培养 2 种子制备的过程 防止杂菌污染 减少转接次数 避免种子培养基的长时高温灭菌 培养基及培养条件是细胞生长繁殖的最适条件 培养时间以对数生长期为宜 3 种子质量的控制 1 影响种子质量的因素及其控制 培养基营养成分丰富 尽可能满足细胞生长繁殖 营养成分尽可能与发酵培养基接近 pH值稳定 培养条件必须是菌种细胞生长繁殖的最适条件 包括温度 pH值 通气搅拌 通风 翻曲 湿度 种龄生命力最为旺盛的对数生长期 细菌 7 24h 霉菌 16 50h 放线菌 21 64h 种子质量的判断细菌 酵母菌 菌体健壮 菌形一致 均匀整齐 一定的排列和形态 霉菌 放线菌 菌丝粗壮 染色力强 生长旺盛 菌丝分枝和内含物情况良好 种子的异常情况菌种生长缓慢或过快 菌丝结团 接种量与菌种特性 种子质量和发酵条件有关 0 1 10 2 种子质量的控制措施 菌种稳定性检查 保藏菌种 无 杂 菌检查 显微镜观察 肉汤或琼脂斜面培养 生化分析 养分消耗速度 pH变化 溶解氧利用 色泽 气味等 二 培养基和培养条件对产酶的影响与调节 一 培养基成分对产酶的影响 1 碳源淀粉及其水解物 2 氮源无机氮和有机氮 3 无机盐类大量元素和微量元素 4 生长因子氨基酸 嘌呤 嘧啶 维生素 激素 5 产酶促进剂表面活性剂 植酸钙镁 LS 聚乙烯醇 EDTA等 二 培养条件对产酶的影响与调节控制 1 pH对产酶的影响与调节控制 细菌 放线菌 中性至微碱性 霉菌 酵母菌 微酸性 培养基pH的改变会影响产酶的种类或比例 调节控制 控制培养基的组分或比例 添加pH缓冲物种 流加酸碱溶液或补料 提高空气流量 2 温度对产酶的影响与调节控制 不同的微生物生长与产酶的最适温度各不不同 很多微生物发酵产酶的最适温度与生长繁殖的最适温度不同 且往往低于生长最适温度 在酶发酵生产的不同阶段控制不同的温度条件 进行变温发酵 调节控制 液态发酵可利用发酵罐的夹套 盘管或蛇管等通过温 冷 水进行调节控制 固态发酵可通过通风量或风温来进行调节 3 溶解氧对产酶的影响与调节控制 临界氧浓度 不影响细胞正常代谢的最低氧浓度 溶氧浓度是由溶氧速率和耗氧速率来决定的 调节控制 调节氧分压改变进气压力或罐压 改变氧含量 添加氧载体 增加通气量 延长气液接触时间 增加气液接触面积 改变培养液的性质改变组分或浓度 添加消泡剂 4 泡沫对产酶的影响与控制 泡沫的不利影响 阻碍CO2的排除 影响O2的溶解 发酵液溢出 造成原料浪费 引起杂菌污染 发酵罐装料量受限 降低发酵罐的利用率 控制泡沫的方法 选育不易产生泡沫的菌种 调节培养基中营养成分 减少或缓加易起泡的原料 机械消泡或化学消泡 化学消泡剂 天然油类 甘油聚 醚 泡敌 聚环氧丙烷环氧乙烷甘油 勤加 少加较好 5 湿度对产酶的影响与控制 对固体发酵产酶而言 影响微生物的产酶量 也会影响产酶达到高峰的时间 特定菌种 发酵过程的不同时期 对湿度要求不同 固态发酵产酶 前期湿度低 后期湿度高 有利于产酶 调节控制 配制培养基时 控制物料的含水量 控制鼓风量大小 或调节空气的湿度 喷洒水分 三 发酵方法 一 液体深层发酵 优点 产酶纯度高 质量稳定 较易控制发酵条件 易自动化控制 机械化程度高 劳动强度小 设备利用率高 缺点 设备投资大 二 固体发酵 固体发酵方式 浅盘培养 转鼓培养 厚层通风培养 优点 设备简单 环境污染少 产酶率高 适合霉菌的培养 困难 传质传热效率低 发酵条件不易控制 产酶不稳定 不能进行胞内酶的生产 缺点 劳动强度大 原料利用率低 产酶纯度差 提取精制 三 分批发酵 四 连续发酵 特点 操作简单 发酵初期营养物过多可能抑制微生物的生长 中后期可能因为营养物的减少及有害代谢产物的积累而降低培养效率 优点 可有效实现自动化 降低劳动强度 设备利用率高 可消除反馈阻遏作用 酶产率高 适合于与生长相偶联的发酵产物的生产 缺点 菌种易变异退化 易染杂菌 原料利用率低 生产成本增加 五 补料分批发酵 优点 可解除营养基质的抑制和分解代谢物阻遏作用 可改善好氧发酵的溶氧状况 减少菌体生成量 提高 有用产物的转化率 菌丝减少可降低发酵液的粘度 便于发酵培养物的输送及后处理 不易产生菌种退化和变异 杂菌污染易控制 使用范围广 四 提高产酶的措施 一 添加诱导物 诱导物类型 作用底物 反应产物 底物类似物 二 降低阻遏物浓度 分解代谢物阻遏 末端产物 反馈 阻遏 三 添加表面活性剂 非离子型表面活性剂 如吐温80 四 添加产酶促进剂 植酸钙镁 聚乙烯醇等 第三节酶发酵动力学 一 酶生物合成的模式 一 细胞生长曲线 细胞生长曲线图 二 酶生物合成的模式 1 同步合成型 酶的合成与细胞的生长同步 合成可以诱导 但不受分解代谢物阻遏和反馈阻遏 酶对应