分子生物学实验复习答案.doc

实验一：DNA的制备1、 为什么分子生物学实验时需要注意EB污染？答：溴化乙锭（EB）可以嵌入碱基分子中，导致错配，故为强诱变剂，具有高致癌性。由于溴化乙锭具有一定的毒性，实验结束后，应对含EB的溶液进行净化处理再行弃置，以避免污染环境和危害人体健康。 2、 DNA加样缓冲液的用途？答：1.增加样品密度以保证RNA或DNA沉入加样孔内;2.使样品带有颜色便于简化上样过程;3.其中的染料在电场中可以预测的泳动速度向阳极迁移3、 DNA电泳时所用的琼脂糖凝胶，其浓度是如何决定的？答：一个给定大小的线性DNA分子，其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成反平行线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kbde DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%，大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%。4、 琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理？答：核酸分子是两性解离分子，DNA分子在高于其等电点的PH溶液中带负电荷，在pH值为8.0-8.3时，核酸分子中碱基几乎不解离，而磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电场中向正极移动。DNA分子在电场中通过凝胶介质而泳动，除电荷效应外，凝胶介质还有分子筛效应，与DNA分子大小及构象有关，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。对于线性DNA分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。 5、 琼脂糖凝胶电泳时胶中DNA是靠什么发出荧光的？为什么？答：核酸染色剂。有EB和Gold View两种，都属于荧光染料，可以嵌入到核酸双链的两碱基对之间，形成一种荧光络合物,在紫外光的激发下，发出荧光。6、 制备基因组DNA时用到的以下试剂分别起什么作用？答：1、CTAB：分离缓冲液，溶解DNA。是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB 与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB 能溶解于乙醇中。2、氯仿：有变性作用，抽提取出蛋白质的污染。 3、无水乙醇：洗去一些盐离子和CTAB 。 4、75%乙醇：沉淀DNA ，使DNA与CTAB分离 实验二：RNA的制备1、 制备RNA时通常要注意什么？为什么？答：1、RNA极易受RNA酶的攻击反应而降解，加上RNA酶极为稳定且广泛存在，因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性。、操作过程中应始终戴一次性手套，并经常更换，以防止收、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶带到试管或污染工具、避免在操作过程中说话聊天、所有玻璃器皿均应在使用前于180度的高温下烘烤6H或更长时间。、配置的溶液应尽可能用0.1%DEPC在37度处理12h以上，然后用高压灭菌锅出去残留的DEPC。2、DEPC有致癌的潜在现已，操作时要小心，一定要戴手套，最好在通风橱中进行，RNase AwayTM试剂可以代替DEPC，操作简单，价格低，且无毒性。2、 制备的RNA通常有那些用途？DNA呢？答：3、 RNA制备好后是通过什么方法检测其是否降解的？从胶上检测什么指标来判断RNA质量好坏？为什么？答：是否降解：1.2%琼脂糖凝胶电泳。在紫外检测仪下观察，完整的总RNA样品应呈现三条带：28S、18S、和5S rRNA。其中28S rRNA条带的亮度应该为18SrRNA条带的1.52倍。反之，说明部分28S rRNA已经降解成18S rRNA。若无清晰条带，则说明样品RNA已严重降解。若加样孔内或孔附近有荧光区带，则说明有DNA污染。质量鉴定：检测RNA溶液的吸光度。280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般的，我们只看OD260/OD280（Ratio，R）。1.82.0时，我们认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，当你用Tris作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会大于2（一般应该是2.2的）。当R2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了。4、 RNA制备好后通过什么方法测定其含量？答：紫外光吸收法。核算在260nm的电磁波下，有最大的吸光度，是区别于其他有机物的重要物理性质，且其吸光度与浓度成正比。利用此性质，可用RNA标准液绘制RNA吸光标准曲线，测定样品RNA浓度。实验三:质粒DNA的制备 1、 什么是质粒？质粒有什么主要用途？答：质粒：细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，常含抗生素抗性基因，是重组DNA技术中重要的工具。用途：能将目的基因通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达，是重组DNA技术中重要的工具。在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。2、 分子生物学实验中用得质粒是野生型改建而来的，它必须具备那三个基本要素？答：1、环状DNA分子能够自我复制，或整合到染色体上，随染色体复制。2、有多个限制酶切点(便于切割)3、有标记基因(便于进行检验)3、 制备的质粒DNA在琼脂糖凝胶上通常以三种形式条带存在，分别是？那种条带形式的质粒DNA其转化或转染效率最高？答：松弛线性的DNA、松弛开环的OC DNA、闭环超螺旋的SC DNA。用于转化的质粒DNA应主要是共价闭环DNA。实验四：感受态细菌的制备及质粒DNA的转化1、 什么是感受态细菌？感受态细菌的主要用途？答：感受态细菌：转化过程所用的受体细菌经过一些特殊处理后，细胞膜通透性发生短暂性的改变，成为允许外源DNA分子进入的状态的细菌。用途：分子克隆、质粒提取、蛋白质表达。2、 什么是转化？转化和转染的主要区别？答：转化：是某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的细胞的DNA而使它的基因型和表型发生相应变化的现象。这现象首先发现于细菌，也是细菌间遗传物质转移的多种形式中最早发现的一种，它不同于通过噬菌体感染传递遗传物质的转导以及通过细菌细胞的接触而转移DNA的细菌接合区别：转化(transformation)指将质粒或其他外源DNA导入处于感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。是裸 DNA 本身，不是通过其他媒介（如病毒）转移到原核生物里面。转染 （transfection）是通过重组噬菌体感染感受态细菌，使遗传物质导入受体细胞，进入感受态细菌的噬菌体DNA可以同样复制和繁殖。3、 有哪些主要因素决定质粒DNA的转化效率？答：1细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。DH5菌株 OD600为 0.5 时细胞密度是 5 107/ml ）；2所使用的试剂的纯度、质量、器皿的洁净程度。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；3质粒的浓度、大小及构型的影响：质粒DNA不超过感受态细胞体积的5% ；分子量越大转化效率越低，超过30Kb的质粒DNA很难转化成功；超螺旋的DNA具有较高的转化效率，重组DNA效率低一些，环状DNA相比线性DNA转化效率高一些。4、 质粒DNA的转化过程可分为哪几个阶段？每个阶段中主要发生了什么事件？答：1、 吸附双链DNA分子吸附于受体菌表面； 2、 转入双链DNA分子解链。一条链进入受体菌，另一条降解； 3、 自稳外源质粒DNA分子在细胞内复制成双链； 4、 表达供体基因随同复制子同时复制，分裂， 转录翻译。5、 什么事转化子？什么事非转化子？答：转化子：受体菌直接吸收了来自供体菌的DNA片段，通过交换，把它组合到 自己的基因组中，从而获得供体菌部分遗传性状的受体菌。 非转化子：不带有异源 DNA(质粒) 分子的受体细胞。实验五：质粒DNA的酶切与鉴定1、 限制性核酸内切酶天然存在于什么生物体内？答：主要来自原核细胞、病毒、酵母菌2、 什么是细菌的限制-修饰系统？限制-修饰系统对细菌的用途？答：限制-修饰系统：原核细胞保护自己，选择性降解外源DNA的一种机制。包括两类酶，即限制性核酸内切酶和DNA甲基化酶。前者负责降解进入原核细胞的外源DNA，后者则对细胞自身的DNA进行甲基化，从而保护细胞的DNA，使其不被细胞内的限制性核酸内切酶降解。用途：降解进入原核细胞的外源DNA，对细胞自身的DNA进行甲基化，从而保护细胞的DNA，使其不被细胞内的限制性核酸内切酶降解。、3、 限制性核酸内切酶有几类？这几类限制性内切酶各有什么特点？可作为工具酶的限制性内切酶是哪一类？为什么?答：三类。I型限制性内切酶是一类兼有限制性内切酶和修饰酶活性的多个亚基的蛋白复合体。它们在识别位点很远的地方任意切割DNA链。尽管I型酶在生化研究中很有意义，但由于不产生确定的限制片段和明确的跑胶条带，因而不具备实用性。II型酶在其识别位点之中或临近的确定位点特异地切开DNA链。它们产生确定的限制片段和跑胶条带，因此是三类限制性内切酶中唯一用于DNA分析和克隆的一类。III型限制性内切酶也是兼有限制-修饰两种功能的酶。它们在识别位点之外切开DNA链，并且要求识别位点是反向重复序列；它们很少能产生完全切割的片段，因而不具备实用价值，也没有人将其商业化。型限制性内切酶：限制、修饰特点：需 Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸为辅助因子；识别位点和切割位点不一致，没有固定切割位点（随机性）应用：不常用。型限制性内切酶：识别并特异切割DNA分子, 即通常所指的DNA限制性核酸内切酶。特点：仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，能识别双链DNA的特殊序列，并可特异切割DNA，产生特异性的片段。应用：种类繁多,分子克隆最常用的内切酶。型限制性内切酶：限制、修饰特点：需Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸为辅助因子；特异切割，切割位点在识别位点外，距识别位点3端24-26bp处应用：数量很少，分子克隆中无实际作用4、 限制性内切酶的识别序列有什么特点？称为什么序列？答：限制酶识别序列的长度一般为 4-8 个碱基，最常见的为 6 个碱基（表2-3）。识别的序列大多数为回文对称结构，切割位点在 DNA 两条链相对称的位置。成为回纹序列。5、 酶通常在什么温度中保存？为什么没在该温度下保存不会结冻？酶最后工作的时候其甘油浓度必须低于多少？答：酶需保存于-20，操作时应将酶保持在冰浴中，避免长时间置于高温中。6、 1个单位（1U）的限制性内切酶代表什么意思？答：1个酶活力单位是指在特定条件（25，其它为最适条件）下，在1min 内能转化1mol底物的酶量，或是转化底物中1mol的有关基团的酶量。实验六：目的基因的PCR扩增1、 PCR反应液中主要成分是那些？有什么作用？答：DNA模板（template），含有需要扩增的DNA片断。2个引物（primer），决定了需要扩增的起始和终止位置。DNA聚合酶（polymerase），复制需要扩增的区域。脱氧单核苷酸（dNTP），用于构造新的互补链。缓冲体系，提供适合聚合酶行使功能的化学环境。2、 为什么在PCR反应过程中，使用三个不同的温度变化？答：变性-退火-延伸三温度点1、变性：加热使模板DNA在高温下（94-95）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链。若低于93则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。2、退火：在体系温度降至37-65，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，使引物与模板链3端结合，形成部分双链DNA。3、延伸：体系反应温度升至中温72，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5到3方向复制出互补DNA，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。3、 用PCR扩增目的基因，要想得到特异性产物需要注意哪些事项？答：实验七：RAPD实验1、 DNA分子标记的特点有哪些?答：1、非PCR（聚合酶链式反应）类 2、以PCR为核心技术的引物技术类3、位点标定PCR类特异性强；灵敏度高；简便、快速；对标本的纯度要求低 2、 RAPD与经典PCR反应的区别有哪些？答：3、 RAPD主要特点？答：1、不需DNA探针，设计引物也无须知道序列信息；2、显性遗传（极少数共显性），不能鉴别杂合子和纯合子；3、技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术；4、DNA样品需要量少，引物价格便宜，成本较低；5、灵敏度高。6、RAPD标记可以覆盖整个基因组，包括编码和非编码区，可以反映整个基因组的变化。实验八：DNA重组及转化实验1、 什么是T-载体？答：聚合酶链反应产物的克隆运载体，线性化后两侧3端各多出一个脱氧胸苷酸(T)。由于PCR产物两侧3端通常含单个脱氧腺苷酸(A)，与T载体之间的A-T互补性可提高PCR产物克隆的效率。2、 什么是T-A克隆？答：利用Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，在每条PCR扩增产物的3端自动添加一个3-A突出端。3、 T-A克隆DNA重组实验的主要步骤有哪些？答：4、 目前获取目的基