原位杂交操作流程.ppt

原位杂交操作流程 冰冻切片的 DIG labeledRNAprobe 原位杂交操作程序一 切片制备用新鲜组织制作6 m厚冰冻切片 37 干燥1 4小时 进行下一步操作 二 预杂交前处理预固定 4 PFA inDEPC PBSPh7 4 RT30 60min4 PFA 多聚甲醛20g1 PBS450ml加热 60 20min 溶解冷却后调pH至7 41 PBS 500mlPBSRT5min 210 PBS 500mlNaCl40gKCl1gKH2PO41gNa2HPO47 7gDEPC水450ml调Ph至7 5DEPC水加至500mlPBS 含0 3 v vTritonX 100 RT15min临用前配制10 TritonX 10015ml1 PBS 500mlPBSRT5min 2 消化 2 g mlProteinaseKinTEbuffer37 10minTE pH8 0Tris HCl1M5mlpH8 0EDTA0 5M1mlDEPC水 500ml0 2 GlycininPBSRT5min 2 50 xDenhart s Ficoll400聚蔗糖1g后固定 4 PFAinPBSRT15minPVP聚乙烯基吡咯烷酮1gBSA牛血清白蛋白1gDEPC水100ml PBSRT3min 20 1M三乙醇胺 TEA 0 25 乙酸酐RT5min 20 1M三乙醇胺 三乙醇胺2 64mlDEPC水200ml用前加入乙酸酐500 lPBSRT5min 2 三 预杂交预杂交50 2h预杂交液 50 去离子甲酰胺5 SSC5 Denhardt s0 02 SDS0 1mg mltRNA四 杂交杂交50 12h以上 五 杂交后处理2 SSC脱去盖膜 片 50 2 SSC清洗37 10min 220 g mlRNaseAinRnsaebuffer37 30minRnsaebuffer 2MTris5ml0 25MEDTA4ml3MnaCl167mlpH8 0DW 1000mlRnasebuffer37 30min2 SSC50 15min 21 SSC 含0 02 SDS 37 15min 25 SDS2ml1 SSC500ml0 1 SSC37 15min 2 Buffer 37 10min 2Buffer 2MTris HClPh7 625ml3MNaCl25mlD W 500ml封闭 0 5 抗体阻断液inBuffer 含0 2 Tween20 37 20min抗体阻断液 1 500抗地高辛抗体in阻断液37 2h 阻断剂1gTween 200 4mlBuffer 37 10min 2Buffer 200mlBuffer 37 10min 2 显色 Buffer 2MTris10ml 1 50NBT BCIPStockSolutioninBuffer 2 24h 3MNaCl6 67mlMgCl22 033g 湿合 避光 D W 180ml浓HCl调pH至9 5D W 200ml终止反应 Buffer RT5min 2流水冲洗5 10min1 甲基绿复染3 10min 水洗 晾干 封固 DNA探针检测石蜡切片中DNA 组织标本 肝穿刺组织 常规石蜡包埋 4 m连续石蜡切片 贴在涂有切片粘合剂的干净载玻片上 58 烤18h 试剂 1 20 SSC2 HBVcDNA Dig探针5 g3 4 多聚甲醛4 0 1mol LPBS pH7 45 0 2mmol LHCl和0 1mol L甘氨酸PBSpH7 46 0 4 TritorX 100PBSpH7 47 蛋白酶 20 g ml8 0 25 乙酸酐 用0 1mol L三乙醇胺配制9 预杂交缓冲液和杂交缓冲液10 AKP标记抗DigFab段二抗 可1 500稀释11 TSM TSM2 配制参阅附录4 12 NBT和BCIP显色液或用AKP显色Kit 操作流程 杂交前处理预杂交杂交杂交后漂洗杂交后检测结果判断 杂交前处理 1 石蜡切片常规脱蜡至水2 0 02MpH7 4PBS洗3 3min3 0 2MHCI20min室温 除去蛋白 4 2 SSC 内含5MEDTA 50 洗30min5 蛋白酶 2 g ml37 20min6 0 1M甘氨酸PBS洗10min室温 中止酶反应7 4 多聚甲醛 20min室温8 PBS洗3 3min9 75 85 95 和无水乙醇各2min 预杂交和杂交 加预杂交液20 l 每片 42 2h 加杂交液10 20ul 每片 内含HBV cDNADig标记探针4 g ml 加盖硅化玻片 将切片置于95 10min 使探针和靶病毒DNA双链打开 变性 然后迅速置于冰上5min 再将切片置于盛有2 SSC湿合内 42 杂交过夜 12 16h 杂交后漂洗 1 将切片置于2 SSC液内振动移去盖片2 2 SSC洗2 10min 55 3 0 5 SSC2 5min 50 4 PBS洗3 3min5 10 醋酸20min室温 阻断内源性碱性磷酸酶6 PBS洗3 3min 信号放大和显示 1 1 500稀释AKP标记抗Dig二抗 37 4h 或4 过夜2 PBS洗3 3min3 TSM1洗2 5min4 TSM2洗2 5min5 显色液在1mlTSM2中加入4 5 lNBT 3 5 l BCIP混合后 显色30min 12h 中间不断观察6 TSM2洗 PBS洗3 3min 核固红或甲基绿衬染7 蒸镏水洗 系列乙醇脱水 二甲苯透明 树脂封片 结果判断 ISH流程 探针合成组织细胞标本的准备ISH试剂的配制操作流程 探针 1 根据文献报道合成PCR引物一对 2 PCR扩增 用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增 3 将PCR扩增产物亚克隆入pGEM2Z质粒 EcoRI和ACCI酶切位点 在大肠杆菌中扩增 纯化 原理 PGEM3质粒购于promega公司 含有位于pUc19MCS侧面的SP6和T7RNA聚合酶启动子 在将所需序列插入MCS后 一个简单的基于lacZ 肽灭活的颜色选择方案将促进重组体的筛选 在体外 将SP6或T7RNA聚合酶加入到含有标记物的三磷酸核苷前体的转录系统中 可允许从任何一方向产生多拷贝DNA插入序列的标记RNA探针 4 利用Roche生产的体外转录标记RNAkit Cat No999644 操作流程参阅 原位检测技术 p132 133 组织细胞标本的准备ISH试剂的配制 所有试剂和用具均用DEPC水处理 操作流程 11 活细胞经4 多聚甲醛固定20min 室温 PBS洗 系列乙醇脱水 2 组织标本 标准取材后 4 多聚甲醛固定6h 用25 遮糖或液氮速冻 切片贴在涂有APES胶的干净载玻片上 3 PBS洗3 3min 冰冻切用4 柠檬酸盐90 保温20min 石蜡切片98 10min 细胞片不用 4 2 g ml蛋白酶K37 20min PBS洗3 3min 5 0 1mol L甘氨酸PBS洗10min 6 0 25 乙酸酐的0 1mol L三乙醇胺 pH8 0 洗10min PBS洗10min 7 预杂交0 2 SSC 50 甲酰胺30min37 8 杂交 滴加杂交液 2 g ml 加一层复盖膜 48 杂交8 12h 9 杂交后洗 2 SSC洗2 5min45 1 SSC洗2 5min室温0 5 SSC洗2 5min室温0 1 SS