「如何减少和避免引物二聚体」.doc

如何避免或减少引物二聚体 汇总引物之间两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3端，即使无法避免，其3端互补碱基也不应大于2个碱基，否则易生成引物二聚体Primer dimer。所谓引物二聚体实质上是在DNA聚合酶作用下，一条引物在另一条引物序列上进行延伸所形成的与二条引物长度相近的双链DNA的片段，是PCR常见的副产品，有时甚至成为主要产物。形成引物二聚体原因1, 最根本的原因是引物之间或者自身存在互补序列。2，模板量过低;3, 引物浓度多大;4, 退火时间过长.可以通过下面的方法来减少引物二聚体：1. 适度减少引物的浓度（0.10.5pm）对于30轮放大足够2. 检查引物的自身结构，有无复杂的2级结构和FORWARD/REVERSE之间的配对，尤其是3端互补结构3. PCR反应体系的配制在冰上进行，最后加TAq酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有认为室温下有些TAQ酶会将多余的引物合成为二聚体。我试过，的确如此。4. 可以考虑加DMSO,甘油，BSA以及其他添加剂，解除引物二聚体。5. 如果PCR产物跑胶足够亮，可以考虑减少上样量，以及胶内显色物质（如减少EB的量）一般PCR体系的引物和的量是过量的，产物浓度不够可以适当增加模板量，而不是引物和。PCR时，引物不要加太多，退火温度适当调高一点。减少PCR产物中引物二聚体的方法:1从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法；2.可能模板有问题；模板浓度过小，适当加大模板量；3.Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度；4.取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的；这点我试过,效果还不错5.所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增强特异性；6.PCR反应体系的配制在冰上进行，最后加TAq酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有人认为室温下有些TAQ酶会将多余的引物合成为二聚体。7.增加循环数；8.降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减少，则考虑增加镁离子浓度（根据扩增片断长度而定，片段长则相应镁离子浓度应该高一些）；9.若降低退火温度，发现还是只有引物二聚体，而且镁离子的浓度在 20-25mmol/l没有区别，则考虑Buffer等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不对。10.以上次的pcr产物作模板二次pcr，可以提高引物与模板的特异性，减少引物二聚体，如果两次时间间隔短的话，可以把原产物稀释1001000倍，如果间隔较长可以稀释50100倍；不管是引物的哪一端形成了二聚体都会随着温度的上升而解开. 而与延伸的时间和温度是没有关系的, 解开后它们就和其他单链一样有着平等的与模板结合的机会. 而且这些半拉子产物比引物更容易与模板结合,首先完成了合成全长单链(酶的催化速率不变,此时所需要的时间当然短). 也就是说到30个循环后,绝大部分都已经完成了全长链的合成,只有少部分形成了长短不一的单链. (这已经不是引物二聚体了)普通的PCR体系来说，30和34个循环的引物和dNTP的量没什么差别，一般来说这两个都是过量的，循环数多了容易发生错配以及酶效率下降的现象，不过一般来说40以内没有什么大问题。看你的片段是600bp左右吗？如果是600bp那就用普通酶扩增即可，因为普通Taq酶在500bp左右得到的片段是完全可信的，较大的片段可以用带有校正功能的酶来PCR。如果你实验室经济条件较好的话，建议你选用高保真酶，或HotStart酶；还有个可选的方法