双链dna中的尿嘧啶核苷酸基板是一个课件

双链DNA中的尿嘧啶的底物的核苷酸切口在人体细胞的修复途径 胞嘧啶 尿嘧啶的水解脱氨生成一个高度突变的DNA碱基病变被认为是一个主要的在活的有机体的自发突变的来源 切口修复途径 这个新的修复功能的AP核酸内切酶在古细菌和人类进化上保守的 针对DNA修复一个可能的进化起源在一个共同的DNA自发损伤机制祖先的所有形式的生命 自发水解脱氨的胞嘧啶 DNA中的尿嘧啶 U 是一个恒定的细胞中的基因组不稳定性的来源 这诱变过程在高温下和在单链DNA中极大的提高 如果不修复 这些尿嘧啶残基发生C T的转换 这是最常见的自发突变 在生物体经常被发现在人类肿瘤人类最主要的嘌呤 嘧啶 AP 的核酸内切酶 APE1 是一种脱氧尿苷核酸内切酶 可以删除在DNA糖基化酶独立的核苷酸尿嘧啶残基APE1切割寡核苷酸含有一个单一的U G碱基对的双链的活动 APE1具有高亲和力的DNA含有U但切割DNA在一个极低的速率双工的MALDI TOFMS分析反应产物表明APE1催化裂解U G双工产生预期的DNA片段5 末端脱氧尿苷酸 经典DNA糖基化酶 发起的BER途径提出的理论问题高效的DNA损伤的修复 因为它会产生高度遗传毒性的中间体 如AP位点和 或堵塞3 末端必须消除了额外的步骤之前启动修复合成 在我们的实验室工作 与其他观察 确定了一种经典的误码率 核苷酸切割修复 NIR 途径 其中一个AP核酸内切酶进行切口5 到受损的碱基在DNA糖基化酶独立的方式 导致在一个自由的3 OH基团适用于DNA聚合酶和5 悬挂损坏的核苷酸17 近红外的核酸内切酶包括大肠埃希菌NFO 酿酒酵母APN1 和人APE1可以直接切割DNA双链在链中的 端基异构2 脱氧核苷 DN 或各种氧化的嘧啶启动去除通过链置换合成耦合在5 裂解的特异性核酸内切酶皮瓣 APE1催化脱氧尿苷核酸内切酶活性 一 时间和一种含有一个单一的尿嘧啶DNA裂解条件依赖性残留的APE1 3 10nm 32P 标记的30聚体的U G双工 杜RT序列上下文 孵育15 180分钟在37 C与10nmAPE1下近红外和误码率的条件 1车道 控制你 G 2车道 但孵育140nm和10nmAPE1hTDGBER Mg2 的反应条件下 3 14车道 1但APE1孵育的BER Mg2 或近红外条件下 b 各种NIR核酸内切酶和ape1 d308a突变作用向你 G双工 3 10nm 32P 标记的30聚体的U G 和 大 T寡核苷酸的双链 杜RT序列上下文 孵育10nm的野生型 WT APE1和10nmape1 d308aNIR下2小时或在各自的NFO和APN1数量有限的条件在37 C 箭头表示的位置为30分钟的反应缓冲液的noncleaved31肽底物 的21聚体ape1 nir位置产品 和20个碱基的DNA糖基化酶产品的位置 一种用于识别的寡核苷酸的近红外活性和相对单碱基损伤序列APE1效率的催化双链DNA底物裂解 1dU RTd TGACTGCATAUGCATGTAGACGATGTGCAT 118 52dU RT GUGd TGACTGCATGUGCATGTAGACGATGTGCAT 1111 73dU22d CACTTCGGAUTGTGACTGATCC 105 84dU DL10d AATTGCTATUTAGCTCCGCACGCTGGTACCCATCTCATGA 10115dU PPd CATCTCATGAAATTGCTATUTAGCTCCGCACGCTGGTACC 207 26dU PSd AGCTACCATGCCTGCACGAAUTAAGCAATTCGTAATCATGGTCAT 2127dU DLd AATTGCTATCTAGCTCCGCUCGCTGGTACCCATCTCATGA 2008dU DL CUGd AATTGCTATCTAGCTCCGCUGGCTGGTACCCATCTCATGA 201 59dU RT20d GGCTGCATAUGCATGTAGCC 104 910dU RT17d GGTGCATAUGCATGTCC 97 811dU RT15d GGGCATAUGCATGCC 8012dU RT13d GGCATAUGCATCC 7213dU RT11d GGATAUGCACC 6114dU RT9d GGTAUGCCC 51 515dU RT20 AUAd GGCTGCATAUACATGTAGCC 109 316dU RT20 GUGd GGCTGCATGUGCATGTAGCC 1010 317dU RT20 AUTd GGCTGCATAUTCATGTAGCC 106 218dU RT20 AUCd GGCTGCATAUCCATGTAGCC 1013 519dU RT20 CUGd GGCTGCATCUGCATGTAGCC 107 5 除了在杜RT30聚体双工 APE1也可以切割在这项研究中使用的寡核苷酸双链多数 表1 APE1催化裂解的效率取决于序列上下文 寡核苷酸长度 和病变的位置 特别是 我们观察到一个非常强大的序列上下文的影响当比较5号断裂 7 2 和7号 0 U G对双链 具有相同的长度和相同的病变位置但非常不同的序列 表1 相反 改变病变位置 同时保持相同的长度和序列上下文 比较4号断裂 11 和5号 7 2 U G复式 在卵裂率适度的影响 1 5倍的差异 的卵裂率也不同的寡核苷酸的长度基板 较短的双链裂解的总体的1 7 8 折叠效率低于 比较长的1号 8 5 9号 4 9 和11号 14 1 2 接下来 我们检查了最近的和遥远的影响基地 远离病变部位多个核苷酸 对APE1邻居催化U G双链断裂 只有温和的影响 1 4到1 5倍的差异 的观察当我们比较两对双链裂解率 第1 8 5 和2号 11 7 和7号 0 和8号 1 5 每个包含你在同一位置 具有相同的的长度和相同的序列上下文除邻近基地侧翼的尿嘧啶在5 或3 侧 分别 表1 更详细地研究了最近的影响邻居基于杜修 我们测得的卵裂率20个U G双链含有不同相邻组碱基尿嘧啶两边侧翼 我们观察到的唯一一个1 3 4 2倍差七U G双链之间的测试 从而确认在duendonuclease最近邻基适度的影响活性APE1 APE1动力学常数催化近红外活性寡核苷酸双链包含一个单一的尿嘧啶残基动力学参数值 KM nM1 6 0 3Vmax nM min9 3 3 1 10 3kcat 1 min0 9 0 3 10 3kcat KM M 1 min 10 6 Kineticsparametersweremeasuredusing30merU Gduplex dU RTsequencecontext underNIRreactionconditions TodetermineKMandkcat thelinearvelocitywasmeasuredandtheconstantswerecalculatedusingLineweaver Burkplots Alldeterminationswereperformedatleastthreetimes APE1切割双链DNA5 到杜核苷酸和毫不含糊地确认机制在尿嘧啶残基的人类AP内切酶作用DNA 重要的是 我们的裂解质谱分析片段显示没有的DNA糖基化酶作用的产品 这意味着APE1切割 在原来的尿嘧啶残基而不是在一个偶然地形成的脱碱基位点 这些结果表明 APE1表现出强烈的偏好不匹配的尿嘧啶残基 这相反 相反的基础偏好APE1作用于5 羟基尿嘧啶和5 6 二氢在双链DNA的描述以前 20 的底物特异性定量评价APE1 的30 聚体的U G的裂解反应动力学参数双工寡核苷酸 杜RT序列上下文 的测定在稳态条件下 所产生的反应产物的MALDI TOFMS分析一个17个碱基的寡核苷酸双链包含一个单一的杜残留孵化 一 与APE1与TDG和APE1 B 通常情况下 10的皮摩尔17个U G双工 du rt17序列上下文 孵育与无论是10nm的近红外光谱在37 APE1条件下进行17小时 或40nm的hTDG在37 C30分钟 然后用10nmAPE1在37 C30分钟下BER Mg2 的反应条件 TDG切除尿嘧啶残留下一个AP位点 这是从转由APE1产生8的下游含有5 DRP渣油裂解产物 结论 这两个实验的结果证实了变性资料页 图1 作用APE1对亚硫酸氢钠和脱氨基胞嘧啶尿嘧啶修复体外重组 APE1切割5 杜残留引起的钠亚硫酸氢钠处理和生成的片段之一核苷酸比相应的BER产品长 在体外重组酶催化活性APE1杜 一 APE1在亚硫酸氢钠处理的DNA双链的作用 亚硫酸氢钠 治疗3 32P 标记的31聚体C G双工孵育与无论是hTDG APE1BER Mg2 的条件下或在10nmAPE1近红外光谱条件 1车道 控制亚硫酸氢钠处理C G双工 2车道 1但hTDG APE1 车道3 6 1但APE1仅为0 5 1 2 和3h 分别 b 在近红外通道体外重组的尿嘧啶残基 10nm40个U nonlabeledG的寡核苷酸双链 DL10序列上下文 是孵育1小时 在37 C在DNA修复蛋白的存在 nonlabeleddNTPs 和 32P dCTP 1 11车道 你 G蛋白的培养可以修复BER或近红外条件下 12车道 40个碱基大小的标记 所有的孵育的尿嘧啶DNA糖基化酶1单位的存在下进行抑制剂 M thermautotrophicusxthmth212NIR酶是同源的 mth212isan古菌同源ofHumanAPE1 包含boththeAP核酸内切酶活动网站和脱氧尿苷 12 人类APE1 但不是大肠杆菌或酵母菌APN1NFO 能切割DNA5 到杜残留 尽管在一个非常缓慢的速度 图1A 瑞典伏特加对于近红外的反应条件和要求在ape1 d308a杜内切酶活性缺失突变表明杜残留 其他的DNA碱基病变之间 对APE1衬底发起的近红外通道 图1b 的DNA序列的上下文对APE1杜核酸内切酶作用的研究活动表明 APE1识别中尿嘧啶DNA序列的宽范围 表1 APE1展品5 10倍的高活性含尿嘧啶碱基对不匹配与典型的U 成对比较 mth212的DNA底物特异性鉴定 10nm的3 32P 标记的30聚体寡核苷酸双链 杜RT序列上下文 THF T U G 大 T 和5ohc G或者与mth212为培养15分钟 55 C或1nm的NFO5分钟在37 C在各自的反应条件 一 作用的mth212对AP位点和尿嘧啶残基 1车道 THF T孵育2 5小时 在55 C 巷2 未治疗的THF T 车道3 7 2 0 5 2 4 10 和20nmmth212 8车道 9车道 1nmNFO U G孵育2 5小时 在55 C 巷10 未治疗的U G 车道11 15 10但0 5 2 4 10 和20nmmth212 16车道 1nmNFO b 的mth212行动 DA和5ohc残留 1车道 未治疗的 大 T 车道2 6 1 2 4 1020 和100nmmth212 7车道 8车道 1nmNFO 5ohc G培养2 5h在55 C 巷9 未治疗的5ohc G 车道10 14 9 2 4 10 20 和100nmmth212 15车道 1nmNFO 箭 S 表示的位置该noncleaved31肽基板 和箭头的位置 P 表示21个碱基的裂解产物 近红外通道的MALDI TOFMS分析 质谱测量做了如上所述 45 通常情况下 10的lesioncontaining皮摩尔寡核苷酸的双链 100 L 孵育与APE 10nm 在近红外区37 C17小时的反应产物2 高氯酸锂沉淀在丙酮中 用脱盐水 然后溶解在水中之前服从MALDI TOFMS测量 获得了在负模式在飞行时间进行MALDI质谱Microflex的质谱仪 Bruker 配备了一个337nm的氮激光脉冲的延迟源提取 制备溶解的矩阵10毫米的3 羟基吡啶甲酸和柠檬酸铵缓冲液少量的dowex 50w50 8 200阳离子交换树脂 矩阵 1 L 被添加到样品 1 L 对靶板允许干 使用参考寡核苷酸校准光谱已知质量 胞嘧啶脱氨的亚硫酸氢钠处理 三十毫克30个碱基的单链寡核苷酸 定期直流RT序列上下文 经亚硫酸氢钠处理使用epitect亚硫酸氢盐试剂盒根据制造商的协议 Qiagen公司 治疗后 其单链寡核苷酸的3 脱氧核糖核苷酸末端标记转移酶 NewEnglandBiolabs公司 在 32P 3 脱氧腺苷三磷酸 虫草素的存在5 三磷酸 5000居里 毫摩尔 和退火的互补含G对所有的C残基链 10nm的亚硫酸