云南省甘蔗白叶病病原巢式PCR检测技术规程编制说明2018征求意见稿.docVIP

云南省甘蔗白叶病病原巢式PCR检测技术规程编制说明2018征求意见稿 1PCR 一、工作简况（一）任务xx年12月，云南省农业科学院甘蔗研究所申请甘蔗白叶病病原巢式PCR检测技术规程云南省地方标准的立项，云南省质量技术监督局将其列入xx年度云南省地方标准制订项目计划，批准由云南省农业科学院甘蔗研究所负责甘蔗白叶病病原巢式PCR检测技术规程地方标准的制定。 （二）起草单位云南省农业科学院甘蔗研究所。 （三）主要起草人表表1主要起草人及任务分工姓名性别职务/职称工作单位任务分工仓晓燕女研究实习员云南省农业科学院甘蔗研究所主要起草人黄应昆男研究员云南省农业科学院甘蔗研究所技术指导李文凤女主任/研究员云南省农业科学院甘蔗研究所技术指导王晓燕女副研究员云南省农业科学院甘蔗研究所技术指导张荣跃男助理研究员云南省农业科学院甘蔗研究所试验、数据分析单红丽女助理研究员云南省农业科学院甘蔗研究所试验、数据分析罗志明男副主任/助研云南省农业科学院甘蔗研究所试验、数据分析尹炯男副主任/副研云南省农业科学院甘蔗研究所试验、数据分析 二、制定标准的必要性和目的意义蔗糖是人类重要的食用消费品，广泛用于食品加工、医药、餐饮、能源等行业，目前全世界蔗糖产量主要于甘蔗和甜菜榨糖，其中甘蔗糖所占比重较大，达到75%以上，在我国糖料作2物是仅次于粮、棉、油的战略型资源。 随着甘蔗产业链逐年延伸完善，甘蔗产业已经成为我国南方主产区的主要产业之一，成为地区经济发展的重要支柱和农民增收的主要经济。 甘蔗白叶病是由白叶植原体引起的一种检疫性甘蔗重要病害，东南亚国家发生尤为普遍和严重，该病可造成甘蔗毁灭性的破坏。 1954年泰国北部南邦府报道，我国台湾1958年报道该病发生，现广泛发生于印度、巴基斯坦、斯里兰卡、日本、老挝、缅甸、菲律宾和越南等东南亚国家。 甘蔗白叶病对甘蔗的危害是毁灭性的，在泰国发病率达5%-35%，每年导致超过2000万美元的损失。 在印度新几内亚，该病害造成栽培品拉格纳损失高达100%，给当地甘蔗和制糖产业造成了巨大的经济损失。 xx-xx年，从云南蔗区调查和检出甘蔗白叶植原体，且扩散蔓延十分迅速，受害甘蔗产量糖分损失严重，给甘蔗安全生产带来了严重灾害威胁。 近年来，白叶病在东南亚国家发生尤为普遍和严重，随着云南桥头堡建设发展战略的深入实施，与东南亚国家在甘蔗科技方面的合作交流加强，国际甘蔗种质资源引进交换工作不断深入，引种国家数量增加，规模、范围不断扩大，由国外引种导致的白叶病侵入风险在不断增加。 而甘蔗白叶病病原巢式PCR检测目前尚无国家、行业标准，本标准的制定可弥补白叶病检测方面的空白，可有效防止白叶病随引种侵入我国，确保我国甘蔗生产安全，同时，本标准将为我国白叶病病害防控提供技术支持。 3 三、主要起草过程（一）成立项目组、查询资料、设计方案接到项目任务书后，起草单位及时成立项目组，确定项目主要内容，编写了项目实施方案，明确项目组成员的分工。 标准起草小组大量查询国内外白叶病病原检测的技术资料。 （二）检测方法的建立及验证标准起草小组进行PCR体系优化和灵敏性、特异性实验，以建立的方法对采自云南、广西蔗区以及出口美国、孟加拉的甘蔗品种/材料进行巢式PCR检测，完成甘蔗白叶病病原巢式PCR检测技术标准制订情况汇报。 （三）征求意见稿起草及审定过程xx年12月，标准起草小组根据云南省相关标准，起草甘蔗白叶病病原巢式PCR检测技术规程（征求意见稿）。 标准起草小组广泛征求大专院校（福建农林大学、云南农业大学）和科研机构（中国热带农业科学院、云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所、福建省农业科学院植物保护研究所、福建农林大学甘蔗研究所、云南省农业科学院农业环境资源研究所、云南农业大学甘蔗研究所）专家对甘蔗白叶病病原巢式PCR检测技术规程（征求意见稿）的意见，并按照专家意见逐条进行修改完善，最终形成甘蔗白叶病原巢式PCR检测技术规程（送审稿）。 2018年1月，标准起草小组提交甘蔗白叶病病原巢式PCR检测技术规程（送审稿），在标准评审会上请专家评审，按照专4家意见逐条修改完善。 2018年4月，标准起草小组提交甘蔗白叶病病原巢PCR检测技术规程（报批稿）。 四、制定（修订）标准的原则和依据，与现行法律、法规、标准的关系（一）制定标准的原则科学性原则。 本标准在专业人员实验室试验的基础上制定，并进行试验反复验证，具有科学性。 实用性原则。 将为我国甘蔗科研、生产和检验检疫部门提供白条病检测的技术方法，同时，在与东南亚等国家深入开展甘蔗品种/材料交换时，可有效避免白叶病传入我国境内扩散蔓延。 规范性原则。 标准文本严格按照GB/T1.1标准化工作导则第1部分标准的结构和编写的要求编写，格式规范。 （二）制定标准的依据本标准制定过程中依据GB/T1.1-xx标准化工作导则第1部分标准的结构标准编写。 本标准与现行法律法规无冲突。 五、主要条款的说明，主要技术指标、参数、试验验证的论述（一）巢式PCR检测方法的建立1.引物5此引物灵敏度和特异性高，是国际上报道较多的植原体检测引物，引物见图1。 2.巢式PCR反应体系优化确定最佳反应条件时，对反应体系的主要因素Mg2+浓度、Taq聚合酶、模板DNA、dNTPs、引物浓度设置不同梯度水平，设计正交试验见表1。 表表11R PCR正交试验设计编号因素25mmolL-1Mg2+(L)20molL-1引物(L)25mmolL-1dNTPs(L)50ng/L模板(L)5UL-1Taq酶(L)11.00.51.00.50.122.51.02.51.00.133.01.53.01.50.143.52.03.52.00.151.00.51.00.50.1562.51.02.51.00.1573.01.53.01.50.1583.52.03.52.00.1591.00.51.00.50.2102.51.02.51.00.2113.01.53.01.50.2123.52.03.52.00.2经PCR实验，选择组合10作为最佳处理条件，即反应体系图图1用于检测白叶植原体16S rRNA基因的引物图解(箭头所指表示本标准中使用引物)6图图2巢式PCR体系优化中Mg2+用量为2.5L、引物用量为1.0L、dNTPs用量为2.5L、模板用量为1.0L、Taq酶用量为0.2L，在此优化体系下条带清晰，重复性好，结果见图2。 3.灵敏度实验为判定本方法的灵敏度，按照上述巢式PCR扩增体系，以阳性对照DNA为PCR模板，以十倍浓度梯度法稀释进行巢式PCR扩增，结果表明，第一次PCR扩增，阳性对照DNA稀释10-4倍后能检测到清晰的条带，结果见图3。 将第一次PCR扩增产物稀释30倍作模板，进行第二次PCR扩增，阳性对照DNA稀释10-10倍后检测到清晰的目的条带，结果见图4，表明本方法具有良好的灵敏度。 图图3巢式PCR第一次扩增灵敏度电泳图1840bp1240bp74.特异性实验PCR产物克隆测序序列在NCBI的Genbank上进行Blastn分析，结果表明，相应序列同源性高达99.8-100，而与其它组植原体相应序列的同源性低于89.9%。 表明本方法具有良好的特异性。 （二）检测方法的验证为验证方法的可操作性、准确性和重复性，采集田间样品进行验证。 1.云南蔗区样品检测从云南保山、临沧蔗区采集甘蔗品种/材料31份，用于甘蔗白叶植原体检测，结果见图5。 2.出口美国、孟加拉甘蔗品种/材料检测对出口美国、孟加拉的21份甘蔗品种/材料进行检测，结果见图6。 图图4巢式PCR第二次扩增灵敏度电泳图1240bp1240b图图5蔗区样品巢式PCR检测8图图6甘蔗品种/材料式巢式PCR检测3.广西蔗区样品检测对采自广西蔗区的21份样品进行检测，结果见图7。 4.结论经田间样品检测，表明本方法具有可操作性、准确性和可重复性。 六、重大意见分歧的处理依据和结果广泛征求中国热带农业科学研究院、云南省农业科学院和云南农业大学等单位的意见。 共收到意见32条，采纳22条，未采纳9条，1条无修改意见。 在征求意见过程中无重大意见分歧。 七、作为推荐性标准的建议建议甘蔗白叶病病原巢式PCR检测技术规程作为推荐性标准发布实施。 八、贯彻标准的措施建议甘蔗白叶病病原巢式PCR检测技术规程发布实施后，建议 （1）落实技术配套措施； （2）加强技术使用监测，确保技术图图7蔗区样品巢式PCR检测9落实到位。 九、预期效益分析甘蔗白叶病是甘蔗上分布广泛、危害严重的重要危险性检疫病害。 近年来，白叶病在东南亚国家发生尤为普遍和严重，随着国际甘蔗种质资源引进交换工作不断深入，引种国家数量增加，规模、范围不