骨桥蛋白对人膝骨关节炎软骨细胞透明质酸表达的影响.doc

www.CRTER.org罗伟，等. 骨桥蛋白对人膝骨关节炎软骨细胞透明质酸表达的影响骨桥蛋白对人膝骨关节炎软骨细胞透明质酸表达的影响罗 伟1，张方杰1，李宇晟1，雷光华1，2 (1中南大学湘雅医院骨科，湖南省长沙市 410008；2中南大学骨科研究所，湖南省长沙市 410008)引用本文：罗伟，张方杰，李宇晟，雷光华. 骨桥蛋白对人膝骨关节炎软骨细胞透明质酸表达的影响J.中国组织工程研究，2016，20(42):6244-6251.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.42.002 ORCID: 0000-0003-1818-3469(罗伟)文章快速阅读：骨桥蛋白对人膝骨关节炎软骨细胞透明质酸表达的影响罗伟，男，1983年生，湖北省广水市人，汉族，2009年北京大学毕业，博士，主治医师，主要从事骨关节外科，关节镜，骨肿瘤的研究。通讯作者：雷光华，博士，教授，中南大学湘雅医院骨科，湖南省长沙市 410008；中南大学骨科研究所，湖南省长沙市 410008中图分类号:R318文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)42-06244-08稿件接受：2016-07-20检测指标：(1)real time PCR法检测各组骨桥蛋白，透明质酸合成酶1，透明质酸合成酶2和透明酸合成酶3 mRNA表达，(2)ELISA法检测透明质酸水平。空白对照组不进行任何干预骨桥蛋白siRNA组以骨桥蛋白siRNA进行干预骨桥蛋白干预组以1 mg/L重组人骨桥蛋白干预体外培养软骨细胞文题释义：骨桥蛋白：1979年Senger等首次报道与恶性转化有关的一种包含RGD整合素结合区的磷酸化糖蛋白与肿瘤的关系，称之为转化相关性磷酸蛋白。后来Franzen等从骨基质和牙齿中分离出一种磷酸蛋白，特性与转化相关性磷酸蛋白相似，人们将其命名为OPN。后来一些学者在不同的组织细胞中发现了骨桥蛋白，因此骨桥蛋白曾被称为44kD骨酸蛋白，PP69、骨延蛋白1、尿蛋白、分泌的磷蛋白、骨唾液酸蛋白、44kD骨磷蛋白和2aR。自1986年来相继克隆了大、小鼠骨桥蛋白，人骨桥蛋白，猪骨桥蛋白，牛骨桥蛋白，鸡骨桥蛋白和兔骨桥蛋白cDNA。近年来，骨桥蛋白在早期细胞免疫应答、肉芽肿炎症、肿瘤发生及转移的作用中倍受关注。反转录酶：是一种存在于部分RNA病毒中具有反转录活性、能以单链 RNA作为模板合成DNA的酶。由反转录酶催化合成的DNA称为互补DNA(cDNA)。反转录酶可用于RT-PCR，将RNA转变为DNA后扩增，以获得 RNA的序列。摘要背景：在骨关节炎病程中，骨桥蛋白水平和透明质酸水平的改变可以使一系列细胞因子和酶表达水平改变，但是软骨细胞中骨桥蛋白高表达是否与透明质酸高表达相关目前尚不清楚。目的：通过调节体外培养人膝骨关节炎软骨细胞的骨桥蛋白水平，观察其对软骨细胞透明质酸表达水平的影响。方法：从人膝骨关节炎软骨组织标本中获取并体外培养软骨细胞，实验分为3组：空白对照组不进行任何干预，骨桥蛋白干预组以1 mg/L重组人骨桥蛋白干预，骨桥蛋白siRNA组以骨桥蛋白siRNA进行干预。采用real time PCR法检测各组骨桥蛋白，透明质酸合成酶1，透明质酸合成酶2和透明质酸合成酶3 mRNA表达，ELISA法检测透明质酸水平。结果与结论：与空白对照组相比，重组人骨桥蛋白干预组透明质酸合成酶1，2，3表达升高，而骨桥蛋白siRNA干预组透明质酸合成酶1，2，3表达下降，3组间透明质酸合成酶1，2，3表达比较差异均有显著性意义(P 0.05)；重组人骨桥蛋白干预组软骨细胞透明质酸表达显著高于空白对照组和骨桥蛋白siRNA干预组(P 0.05)。结果说明，提示骨桥蛋白可以通过刺激透明质酸合成酶分泌进而诱导骨关节炎软骨细胞透明质酸表达。关键词：组织构建；软骨细胞；骨桥蛋白；透明质酸；透明质酸酶；骨关节炎；国家自然科学基金主题词：骨桥蛋白；软骨细胞；透明质酸；骨关节炎；组织工程基金资助：国家自然科学基金资助项目(81401838)；中南大学自由探索计划(2012QNZT095)3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 Effect of osteopontin on the expression of hyaluronic acid in human knee osteoarthritic chondrocytesLuo Wei1, Zhang Fang-jie1, Li Yu-sheng1, Lei Guang-hua1, 2 (1Department of Orthopedics, Xiangya Hospital of Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China; 2Institute of Orthopedics, Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China)AbstractBACKGROUND: Both osteopontin and hyaluronic acid involve in the pathological process of osteoarthritis, resulting in the abnormal expression levels of various cytokines and enzymes. However, the relationship between the high expression of osteopontin and hyaluronic acid in chondrocytes remains unclear.OBJECTIVE: To investigate the effect of osteopontin on the expression of hyaluronic acid in human knee osteoarthritic chondrocytes in vitro by modulating the level of osteopontin.METHODS: Chondrocytes from human knee osteoarthritic cartilage were cultured in vitro, and were then divided into three groups: blank control group without any treatment; osteopontin group and and pontin siRNA group were treated with 1 mg/L recombinant human osteopontin and osteopontin siRNA, respectively. Expression levels of osteopontin, hyaluronic acid synthase 1, 2 and 3 mRNA were detected by real-time PCR, and the levels of hyaluronic acid were measured using ELISA.RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the blank control group, the mRNA expressions of hyaluronic acid synthase 1, 2 and 3 were remarkably increased in the osteopontin group, while siRNA made the significantly inhibitory effects on the hyaluronic acid synthase 1, 2 and 3 mRNA expressions (P 0.05). The level of hyaluronic acid in chondrocytes in the osteopontin group was significantly higher than that in the other two groups (P 1.8， 检验总RNA纯度并计算其浓度符合实验要求。1.4.7 总RNA反转录反应 应用反转录试剂盒(RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit，Fermentas.)，按照说明书进行操作。人骨桥蛋白、-actin、透明质酸合成酶1，2，3 Real time Q PCR引物序列由上海Invitrogen公司合成。见表2。表2 引物序列Table 2 Primer sequences引物名称引物序列骨桥蛋白-Forward primer5-gtg gga agg aca gtt atg aa-3骨桥蛋白-Reverse primer5-ctg act ttg gaa agt tcc tg-3-actin- Forward primer5-gga aat cgt gcg tga cat ta-3-actin-Reverse primer5-gga gca atg atc ttg atc ttc-3透明质酸合成酶1-forward primer5-gcg ata ctg ggt agc ctt ca-3透明质酸合成酶1- reverse primer5-ggt tgt acc agg cct caa ga-3透明质酸合成酶2-forward primer5-aca gac agg ctg agg acg ac-3透明质酸合成酶2-reverse primer5-ctg tga ttc caa gga gga g-3透明质酸合成酶3-forward primer5-gtc atg tac acg gcc ttc aa-3透明质酸合成酶3-reverse primer5-cct act tgg gga tcc tcc tc-31.4.8 Real time Q PCR反应 25 L反应体系，操作步骤按照Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2X)，Fermentas.说明进行。实验结果以cDNA分别和3对引物进行Real time Q PCR反应，获得扩增曲线、熔解曲线，依据Ct值计算2-Ct，其中Ct =样本A(目的基因Ct值-内参基因Ct值)-样本B(目的基因Ct值-内参基因Ct值)，得出骨桥蛋白，透明质酸合成酶1，透明质酸合成酶2和透明质酸合成酶3的mRNA相对水平。1.4.9 Western blot检测蛋白表达 分析结果以Gel pro4.0 版凝胶吸光度分析软件进行分析，测其IOD (integrated optical density)累积吸光度参考值。1.4.10 ELISA法检测透明质酸浓度(检测范围及各标准品浓度：0，50，100，500，1 000，2 000 ng/L) 应用固相夹心酶联免疫吸附实验技术的透明质酸检测试剂盒。使用纯化的抗体包被微孔板，使其充分吸附在微孔壁上，制成固相的载体。实验过程中加入标准品、待测样品、生物素标记物和酶标记物与包被在微孔上的抗体一起温育反应使其充分结合在微孔壁上，若样品中含有该因子的抗原则会形成抗体，抗原，抗体复合物。反应过后冲洗掉未结合的部分，再加入底物反应，底物在酶的作用下变为蓝色，并在酸的作用下转化为最终的黄色。通过读取吸光度值来绘制出标准曲线，并在标准曲线上反算出待测样品的浓度。1.5 主要观察指标 不同干预组间骨关节炎软骨细胞中目的基因骨桥蛋白，透明质酸合成酶1，2，3 mRNA的扩增曲线、熔解曲线及表达量的差别；不同干预组间骨关节炎软骨细胞中透明质酸表达水平的差异。1.6 统计学分析 实验数据采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析，所有实验数据均以s表示，采用Student-Newman-Keuls检验分析比较干预前后水平变化，P 90%)(图1C)；MTT检测示各组间细胞生存率差异无显著性意义(P 0.05)(图1D)；mRNA鉴定示mRNA完整(图1E)；Real timePCR结果显示：与NC-siRNA组对比，各组siRNA均显著降低骨桥蛋白mRNA表达(P 0.05)，以siRNA-1最为明显(图1F)，选取siRNA-1作为后续试验干预序列。2.2 标准曲线绘制及分析 Real time PCR 熔解曲线提示，内参基因-Actin及目的基因骨桥蛋白、透明质酸合成酶1、透明质酸合成酶2、透明质酸合成酶3的熔解曲线呈单峰且熔解温度均一(图2A-E)，扩增曲线均接近S型曲线。2.3 各组间骨桥蛋白mRNA、骨桥蛋白蛋白、透明质酸合成酶1，2，3 mRNA以及透明质酸表达的差异 与空白对照组相比，重组人骨桥蛋白干预组骨桥蛋白mRNA升高(3.530.17)倍，骨桥蛋白siRNA干预组骨桥蛋白mRNA水平降低(0.620.21)倍，3组之间差异有显著性意义(P 0.05)，见图3A。 与空白对照组相比，重组人骨桥蛋白干预组骨桥蛋白表达水平升高(1.680.23)倍，骨桥蛋白siRNA干预组骨桥蛋白表达水平降低(0.720.20)倍，3组之间差异有显著性意义(P 0.05)，见图3B。与空白对照组相比，重组人骨桥蛋白干预组透明质酸合成酶1 mRNA表达水平升高(2.320.23)倍，骨桥蛋白siRNA干预组透明质酸合成酶1 mRNA表达水平降低(0.510.05)倍，3组之间差异有显著性意义(P 0.05)，见图3C。与空白对照组相比，重组人骨桥蛋白干预组透明质酸合成酶2 mRNA表达水平升高(3.310.10)倍，骨桥蛋白siRNA干预组透明质酸合成酶2 mRNA表达水平降低(0.590.02)倍，3组之间差异有显著性意义(P 0.05)，见图3D。与空白对照组相比，重组人骨桥蛋白干预组透明质酸合成酶3 mRNA表达水平升高(7.280.31)倍，骨桥蛋白siRNA干预组透明质酸合成酶3 mRNA表达水平降低(0.370.06)倍，3组之间差异有显著性意义(P 0.05)，见图3E。 与空白对照组(299.73.00) ng/L相比，重组人骨桥蛋白干预组透明质酸表达水平升高(884.007.61) ng/L，骨桥蛋白siRNA干预组透明质酸表达水平降低(207.02 4.07) ng/L，3组之间差异有显著性意义(P 90%)软骨细胞已转染siRNA(100)；D为MTT检测示各组间细胞生存率差异无显著性意义(P 0.05) (NC：阴性对照)；E为mRNA鉴定，1：marker；2，4，6：NC-siRNA；3：siRNA-1；5：siRNA-2；7：siRNA-3；显示mRNA完整(骨桥蛋白条带(460 bp)和-Actin条带(360 bp)均清晰完整)；F为骨桥蛋白siRNA干预后，骨桥蛋白mRNA表达。1 2 3 4 5 6 7FED1.21.00.20骨桥蛋白相对表达(倍)120100806040200软骨细胞存活率(%)NC-siRNA siRNA-1 siRNA-2 siRNA-3NC-siRNA siRNA-1 siRNA-2 siRNA-3CBAED图2 Real time PCR 熔解曲线分析Figure 2 Melting curves of real-time PCR图注：A为-actin熔解曲线；B 为骨桥蛋白熔解曲线；C为透明质酸合成酶1熔解曲线；D为透明质酸合成酶2熔解曲线；E为透明质酸合成酶3熔解曲线。软骨细胞HAS1表达(倍)CBA321043210软骨细胞骨桥蛋白mRNA表达(倍)骨桥蛋白GAPDH 对照组 siRNA 重组人骨桥蛋白空白对照组 重组人骨桥蛋白组 骨桥蛋白siRNA组 空白对照组 重组人骨桥蛋白组 骨桥蛋白siRNA组 软骨细胞HAS2表达(倍)软骨细胞HAS3表达倍)软骨细胞透明质酸(ng/L)FED1 0008006004002000108642043210空白对照组 重组人骨桥蛋白组 骨桥蛋白siRNA组 空白对照组 重组人骨桥蛋白组 骨桥蛋白siRNA组 空白对照组 重组人骨桥蛋白组 骨桥蛋白siRNA组 图3 各组间骨桥蛋白mRNA、骨桥蛋白蛋白、透明质酸合成酶(HAS)1，2，3 mRNA以及透明质酸表达的差异Figure 3 Comparisons of the expressions of osteopontin mRNA and protein, hyaluronic acid synthase 1, 2 and 3 mRNA, and hyaluronic acid among groups图注：图A为各组软骨细胞骨桥蛋白mRNA表达；B为骨桥蛋白的蛋白表达水平；C为组间透明质酸合成酶1mRNA水平(P 0.05)；D为组间透明质酸合成酶2mRNA水平(P 0.05)；E为组间透明质酸合成酶3 mRNA水平(P 0.05)；F为组间透明质酸水平(P 0.05)。白与透明质酸水平都存在一致性19-20；有研究发现滑膜成纤维细胞中，骨桥蛋白和透明质酸共同参与了骨关节炎滑膜炎的发病病理过程。在乳腺癌细胞中，骨桥蛋白可以调节透明质酸合成酶2表达而增加透明质酸水平进而促进癌细胞浸润21。研究在此基础上，证实了在骨关节炎软骨细胞中，骨桥蛋白可以影响透明质酸的表达，且透明质酸水平随骨桥蛋白水平改变而改变，两者之间的共同作用可能参与了骨关节炎的发病病理过程，然而具体机制尚不明确。同时，实验结果显示，在3种透明质酸合成酶 mRNA中，透明质酸合成酶3 mRNA表达水平改变的幅度最大，但是透明质酸表达水平变化幅度与透明质酸合成酶1和透明质酸合成酶2 mRNA表达水平变化幅度相类似。人体中具有3种透明质酸合成酶基因，3种透明质酸合成酶具有高度相同的序列和结构同源性，都包含2个N端和5和C端跨膜域，以及约80%相同序列的中心细胞质区域。实验发现，3种透明质酸合成酶的稳定性不同，延伸透明质酸的效率以及产生的透明质酸长度也不同1-2。体外实验中透明质酸合成酶1产生的透明质酸相对分子质量为105-106 u， 而透明质酸合成酶2和透明质酸合成酶3的产物分子量约为其2倍，透明质酸合成酶2的产物分子量甚至可以大于2106 u 1。透明质酸合成酶2是人关节软骨和体外培养的软骨细胞中的最主要的透明质酸合成酶形式，它在生成组织所必需的透明质酸和维持正常软骨基质方面具有关键作用2，22。透明质酸合成酶3同样在关节软骨和肥大的生长板软骨细胞中表达2，22-23 ，但是表达水平低于透明质酸合成酶2，而体外培养的软骨细胞则不一定可以表达透明质酸合成酶122。这与本实验的结果是一致的，虽然透明质酸合成酶3 mRNA表达水平改变的幅度最大，但是透明质酸表达水平变化幅度与透明质酸合成酶2 mRNA表达水平变化幅度最为相关。实验研究发现，骨桥蛋白和透明质酸均参与了骨关节炎一系列病理过程：在人膝骨关节炎患者的血浆，滑液和关节软骨中骨桥蛋白水平上升并与关节破坏程度相关16-17。可受骨桥蛋白调控的金属基质蛋白酶13、型胶原和蛋白聚糖等在骨关节炎的病理过程中也具有重要地位。透明质酸可以通过降低肿瘤坏死因子和白细胞介素8等而在骨关节炎中发挥抗炎作用10-11。血清透明质酸水平可作为放射学骨关节炎的生物学标志12。最近有研究发现滑膜成纤维细胞中，骨桥蛋白和透明质酸共同参与了骨关节炎滑膜炎的发病病理过程。然而，骨桥蛋白和透明质酸的关系以及在人骨关节炎关节软骨中，骨桥蛋白能否影响透明质酸的表达仍不明确。研究证实，在人膝骨关节炎软骨细胞中，骨桥蛋白可以通过调控透明质酸合成酶分泌进而诱导骨关节炎软骨细胞中透明质酸的表达，初步揭示了骨桥蛋白和透明质酸的共同作用参与了骨关节炎发病病理过程。实验中发现骨桥蛋白可以诱导骨关节炎软骨细胞中透明质酸的表达，目前，尚未见相关类似研究报道。然而，有关两者共同作用的具体机制并不清楚，亟需进一步研究探索。结论：骨桥蛋白可以通过调控透明质酸合成酶分泌进而诱导骨关节炎软骨细胞透明质酸表达。致谢：感谢医学遗传学国家重点实验室工作人员提供相关技术支持。作者贡献：第一作者进行实验设计、实施和成文，通讯作者审校。利益冲突：所有作者共同认可文章内容不涉及相关利益冲突。伦理问题：受试者对本研究有一定了解，并在自由意志下同意获取实验标本，对所提供标本者无人身损害，并签署术中无偿提供软骨组织知情同意书。研究方案获医院伦理委员会批准。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。作者声明：第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。4 参考文献 References1 Pavlovi M, Adami M, Schuller Petrovi S.The actual role of hyaluronic acid-based and calcium hydroxylapatite soft tissue 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