微生物工程03菌种

第三章 微生物优良菌种的选育,微生物发酵的一般流程,提纲,微生物优良生产菌种的特征自然突变选育诱变选育 原理 基本方法杂交育种 细菌 放线菌 霉菌 酵母菌原生质体融合基因工程技术 基因表达系统 利用大肠杆菌的基因表达系统 利用酵母菌的基因表达系统 基因工程菌的稳定性,优良菌种应具备的特征,对菌种的要求生产力：能在廉价的培养基上迅速生长，所需的代谢产 物的产量高，其它代谢产物少操作性：培养条件简单，发酵易控制，产品易分离稳定性：抗噬菌体能力强，菌种纯粹，不易变异退化安全性：是非病源菌，不产有害生物活性物质或毒素,优良菌种应具备的特征,选择生产菌种应注意的因素1.原料方面：广,转化率高；2.产物方面：目的产物含量高,副产物少；3.菌体方面：生长快、繁殖力强，耐受力强，抗污染、抗噬菌体能力强，遗传特性稳定4. 设备方面：产泡沫少，适宜大罐生产。（培育条件异，周期短，需氧量小，抗污染能力强）,一、自然选育,利用微生物自然突变进行的菌种选育。原因：多因素低剂量的诱变效应；互变异构效应结果：负变大于正变，应经常分离纯化方法：菌悬液平板分离上摇瓶检测选种保藏优点：简单易行，可与生产同步进行。缺点：频率低，10-810-9 /次分裂。,二、诱变选育,诱导微生物发生突变进行的菌种选育，包括诱变和筛选两个步骤。原理：染色体畸变；基因突变。影响诱变的因素：出发菌株；诱变剂的种类与剂量。诱变剂：能提高基因突变频率的物理、化学、生物因子。筛选的方法：通过选择/鉴别培养基加以识别。初筛复筛确定最佳发酵条件,.营养缺陷型突变株筛选,酶缺陷，结果造成中间产物积累；解除协同反馈，使另一分支末端产物积累；渗漏型突变（酶未完全丧失活性，下降），末端产物少，中间产物积累。,2.抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变株筛选,调节基因或操纵基因突变，产生的阻遏蛋白与不能结合或结合；结合，但不发生作用；结构基因突变，使结构酶无结合能力但有催化活性；方法：末端产物结构类似物筛选；营养缺陷型回复突变株筛选,3.组成型突变株筛选,突变发生在调节基因或操纵基因,解除对诱导物的依赖,可获组成型突变株。筛选方法：设计条件使组成型优势生长，或通过菌落分辨。加诱导酶合成抑制物交替培养法显色反应法,.抗（敏感）性突变株筛选,包括：抗生素、金属离子、温度、噬菌体 抗生素抗性突变：提高产量 抗噬菌体突变：消除噬菌体污染 条件抗性突变：如温度，可提高产量 物敏突变：如氟乙酸敏感突变型，顺乌头酸 酶活性极低，异柠檬酸产量少， 柠檬酸积累。,三、杂交育种,借助有性重组，使不同菌株的遗传物质得以交换1.细菌的杂交育种方法：转化、转导、F因子转导、R因子转移、接合。获部分合子。出发菌株需带遗传标记：营养缺陷、抗生素抗性、温敏、发酵性能2.防线菌的杂交育种 基因重组过程近似细菌，育种方法与霉菌相似放线菌的遗传体系和杂交原理异核现象；接合现象；异核系的形成；重组体的形成。放线菌的杂交方法混合培养法；平板杂交法；玻璃纸转移法,三、杂交育种,.霉菌的杂交育种准性生殖过程：不通过有性生殖的基因重组过程异核体的形成；杂合二倍体形成；体细胞重组。霉菌的杂交技术：诱变获具标记的亲本异核体的形成；双倍体检出；分离子检出。.酵母菌的杂交育种双单特性：存在单倍体和二倍体的生活史二倍体生活力强，生产能力高，可通过杂交得二倍体来育种。方法：获单倍体细胞；杂交。杂交方式：孢子与孢子；孢子与单倍体细胞；单倍体细胞间。,四、原生质体融合育种,借助原生质融合技术实现遗传物质的交换.原生质体融合的优越性： 受限制小； 重组频率高； 遗传物质传递更充分； 可先用理化因子处理； 其诱变率更高。.原生质体融合法： 原生质体制备 原生质体融合和再生 融合子的检出.原生质体融合技术在微生物育种中的应用： 选育高产优质菌株 产生新的产物,五、基因工程育种,定向育种，技术含量高，应用面广。应用：解决了一些药物或材料来源困难，或制造技术复杂，或造价昂贵而无法大量生产和应用的问题。 产生了巨大的经济和社会效益。工业生产的意义：基因的表达产量； 表达产物的稳定性； 产物的生物活性； 产物分离纯化。（一）基因表达系统 从育种的角度考虑,最重要的是目的基因的高效表达。.原核表达系统；.真核表达系统,1.原核表达系统,原核生物不适宜表达需后加工处理的那一部分真核基因 不能切除mRNA的内含子； 不能进行蛋白质的糖基化； 不能对氨基酸进行修饰。大肠杆菌：遗传背景清楚；基因操作简便；易培养，世代短，生长快；适宜大规模生产注意：真核蛋白后修饰； 多为胞内产物；产物分离纯 化困难；内毒素；蛋白酶破坏产物；免疫反应。枯草芽孢杆菌：分泌能力强；胞外蛋白酶强链霉菌：使用安全；分泌能力强；具有糖基化能力,2、真核表达系统,产生的蛋白质与天然蛋白质具有一致的生理生化功能酵母：真核生物蛋白质的最佳表达系统 优点：基因组小，操作方便； 世代周期短， 易培养； 有单、双倍体形式；能糖基化；能分泌产物到胞外。 应用：干扰素、乙肝表面抗原基因已经成功表达； 酿酒酵母研究、应用最广泛。丝状真菌： 特点：能进行翻译后加工； 表达产物分泌能力强；安全； 发酵、纯化工艺成熟。,（二）利用大肠杆菌的基因表达系统,.表达载体条件： 能独立复制； 有灵活的多克隆位点和方便的筛选标记，位点位 于 起动子后； 有很强的起动子，能被大肠杆菌的RNA聚合酶识别； 有使起动子受抑制的阻遏子，受诱导时才转录，可人 为的通过理化因素选择启动时机； 有很强的终止子，使RNA聚合酶集中力量转录克隆 的外源基因； 产生的mRNA须有翻译的起始信号，即起始密码 AUG和SD序列。,.影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素,目的基因的表达产量与每个细胞平均表达量和细胞浓度正相关。影响因素：外源基因的拷贝数；外源基因的表达频率； 启动子的强度；AUG和SD序列的间距；密码子的组成；核糖体结合位点的有效性表达产物的稳定性；细胞的代谢负荷。,.在大肠杆菌中真核基因的表达形式,融合蛋白：N端原核序列，C端真核序列表达高效、稳定，但影响免疫原性，可酶切。非融合蛋白：保持生物活性，但易被水解 N端常带甲硫氨酸，引起人体免疫反应。分泌表达蛋白：使外源基因位于原核蛋白 信号肽下游（连接、构建）。 在周质空间酶切，释放产物。,（三）利用酵母菌的基因表达系统,.载体系统：多用穿梭载体，同时带有细菌和酵母 的复制原点和选择标记，在两者中复制、选择。克隆载体的复制序列酵母附加质粒(YEP)酵母复制型质粒(YRP)酵母着丝粒质粒(YCP)酵母整合型质粒(YIP)表达载体 在克隆载体中插入酵母表达盒和终止子等调控序列,即可构建酵母表达载体。 需糖基化才有生物功能的重组蛋白必须是分泌型蛋白.要在外源DNA上游加前导肽序列。,2.影响外源基因在酵母中表达的因素,外源基因的拷贝数：拷贝数，稳定性，整合位置；外源基因的表达频率： 启动子：有上游激活序列、TATA序列、起始密码子； 分泌信号：包括信号肽、前导肽序列；终止序列：合成基因须加或利用载体上的；外源蛋白的糖基化：分泌过程中发生N-糖苷键和O-糖苷键连接的两种糖基化，其产物与天然产物完全相同宿主菌株的影响：生长力强、内源蛋白酶弱、性能稳定、分泌力强，用二、多倍体。,(四)基因工程菌的稳定性,分裂不稳定：分裂时，出现一定比例不含质粒的子代菌；结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失、碱基重排或缺失。1.产生原因：（常见是分裂不稳定） 产不含质粒的子代菌的频率； 两种菌的比生长速率。 质粒拷贝数低时，可增加，但不宜太高（生长负势 ）。 条件有利，高比生长速率，拷贝数降低，但更稳定