DNA序列测定

第九章 DNA序列测定,末端终止法-待测单链DNA 模板 引物 四种dNTP(其中一种用32P/35S标记) 终止剂(ddNTP) DNA聚合酶 Sanger发明：两次获得诺贝尔奖 分别得到ddA ddT ddG ddC结尾的片段,测序过程:1.模板与引物杂交2.引物的延长和合成阻断四个试管分别加入 DNA聚合酶 dNTP 标记底物终止剂不同 ddA ddG ddC ddT四个试管中所有产物是一系列长度只差一个核苷酸的聚合链3.电泳 ACGT次序 高压电泳4.放射自显影得到直读图象,第十章 核酸分子杂交技术,概念：具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下，按碱基配对原则形成双链的过程。探针 待测核酸 杂交分子核酸分子杂交的基本原理核酸分子杂交的基本方法探针的标记,核酸分子杂交的基本原理,DNA变性方法热变性：90100酸碱变性：常采用碱变性化学试剂变性：尿素、甲酰胺、甲醛等特点：粘度增加、密度增加、增色效应、溶解温度(melting temperature,Tm)DNA复性或杂交(hybridization)DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等,影响杂交的因素,核酸分子的浓度和长度浓度大，复性快；分子量大，复性慢温度离子强度杂交液中的甲酰胺核酸分子的复杂性非特异性杂交反应预杂交：封闭非特异性杂交位点，用鲑鱼精子DNA,分子杂交的基本方法,Southern 印迹法Northern 印迹法斑点印迹杂交原位杂交Western 印迹法液相杂交,bp1534 994 695 515 377 237,A B C M,Southern 印迹杂交,1975年，英国Southern创建DNA/DNA杂交，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。,Southern 杂交(Southern bloting)的主要步骤,待测DNA样品的制备、酶切待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳凝胶中DNA的变性：碱变性Southern转膜：硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法探针的制备 Southern杂交杂交结果的检测,Northern 印迹杂交(Northern bloting),检测RNA（主要是mRNA）的方法与Southern杂交的不同靶核酸：RNARNA电泳转膜：不需变性,斑点印迹杂交(dot bloting),将RNA或DNA变性后直接点样于NC膜或尼龙膜上优点：简单、快速、可同时检测多个样品,原位杂交(in situ hybridization),将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。特点能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态,核酸原位杂交的基本步骤,细胞或组织的固定：载玻片组织细胞杂交前的预处理用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质探针的选择和标记杂交杂交结果检测,Western 杂交印迹法(Western bloting),检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法主要步骤：蛋白质样品的制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳蛋白质的电转移：NC膜靶蛋白的免疫学检测靶蛋白于第一抗体（一抗）反应与标记的第二抗体（酶标二抗）反应显色反应：酶促反应,液相杂交,核酸分子与核酸探针存在于杂交液中RNA酶保护分析法核酸酶S1保护分析法,探针的标记,探针的种类cDNA 探针、基因组DNA探针、寡核苷酸探针、RNA探针标记物核素标记物（同位素标记）：32P、35S、3H等非核素标记物（非同位素标记）：生物素、地高辛、荧