动物模型的建立与应用20121动物模型概述

动物模型的建立与应用（一）,解放军总医院医学实验动物中心 陈华Email :(66)939722动物模型的建立与应用（一）,动物模型的定义动物模型的分类自发性动物疾病模型诱发性动物疾病模型,遗传修饰动物模型动物模型的选择应用动物实验结果的外推,动物模型（animal models）是指在生物医学研究中所建立的可模拟人类疾病或功能状态的动物实验对象和材料。 动物模型（美国国家衰老研究动物模型研究委员会）：可以用来进行生物学、行为学、自发或诱发性病理过程研究，能够表现一个或多个方面类似人类或其他动物种类的研究模型。“an animal model in which normative biology or behavior can be studied, or in which a spontaneous or induced pathological process can be investigated, and in which the phenomenon in one or more respects resembles the same phenomenon in humans or other species of animal”.,一、动物模型的定义,“动物模型”最常用于模拟人类。研究的焦点不是所用动物的情况，而是这一动物生理学表现针对我们人类或其他动物种类的类推。因此，在这种情况下称“人类模型”将会更正确。“实验动物科学”和“动物实验”所涉略的人类确实比任何其他“动物”种类多得多。“动物模型”最常用于疾病研究。动物模型可用来模拟生物学、行为学或病理学过程，但是，大多数实验动物模型开发和应用于研究人类异常状态的诱因、机制和治疗。,动物模型来源于整个动物王国，许多关于人类生理学的知识来自于从进化发展的角度与人类很远的动物种类的研究。果蝇在基础遗传学研究方面的贡献就是一个很好的例子。动物模型实际上应用于生物医学研究的所有领域。事实上，所有的医学知识和治疗手段，尤其在二十世纪，都与实验动物有关。,仅仅在过去的50年中，医学领域已经取得了显著的进展，包括：脊髓灰质炎（小儿麻痹）疫苗的研制、肺炎等感染性疾病抗体的研制、慢性疾病治疗药物的研制，如：高血压、溃疡和糖尿病。今天，治疗这些疾病的方法继续取得进展，而同时，许多其他的疾病继续折磨着我们，如：肿瘤、囊性纤维化、AIDS、老年痴呆等。 18世纪以后医学知识的迅速增长主要归功于实验动物应用的增加，据统计，1901-2009年，2/3的诺贝尔生理或医学奖的成果归功于动物实验研究的发现。,应用动物模型的历史,人类与其他动物的解剖和功能完全相同的假设：伽林（Galen）,生活在公元2世纪的希腊医生和哲学家，是延续几个世纪的医学权威，在西方被认为是实验生理学的奠基人。他的解剖学研究几乎完全是基于对猿猴和猪的研究，并将研究结果直接推用到到人类，导致了很多错误。直至16世纪末期。人们才开始批评伽林使用了错误的方法。生物医学研究的“诱发性动物模型” ：1865年，法国生理学家克劳德伯纳德（Claude Bernard）出版：医学实验研究指南（Introduction to Study of Experimental Medicine）。开始提出动物实验研究的一些原则和标准，并引领了应用化学和物理的方法诱发动物疾病模型的研究。“疾病的微生物学说”：法国的路易斯巴斯德和德国的罗伯特科赫向医学领域引入了特异性的概念和“疾病的微生物学说” ，进一步建立和推广了动物实验研究和应用。科赫对霍乱和结核的研究进一步促进了“动物模型”在感染性疾病的应用。,动物模型的重要性,人类疾病的发生、发展是十分错综复杂的，以人本身为实验对象而进行临床研究束服了医学的发展，因为有些临床试验，在时间和空间上存在着局限性，而有些试验在道义上和方法学上行不同。,临床上对外伤、中毒等研究不可能在人体重复进行，科学数据绝不能通过使人遭受损害而获得和收集。 难于研究发病率低、潜伏期长和病程长的疾病。 人类本身的疾病十分复杂，病人的年龄、性别、体质、遗传、甚至是社会因素都对疾病的发生发展产生影响。 采集样品、组织标本十分困难。 新的治疗药物的发现、研制；新的治疗手段的测试。,建立人类疾病的动物模型，就可以将那些在人身上无法进行的试验在动物身上实现，进而再推用到人类，从而推动了医学的发展。动物模型对医学的发展起着无可非议的推动作用，这可追溯到血液循环机理的阐明、麻醉药物的运用，以及细菌、病毒的首次发现。近代医学中，单克隆抗体的制备、器官移植的成功、“试管婴儿”的诞生等等，都是首先从动物模型起步的。,二、动物模型的分类,探索性（exploratory）动物模型：用于了解生物学机制，而这一机制可以是正常生物学的基础，也可能是与某个异常生物学功能相关。消化生理研究解释性（explanatory）动物模型：用于了解一个更复杂或更简单的生物学问题。解释性模型不是必须应用动物，也可应用物理的或数学的模型系统来阐释复杂的机制。发热模型预测性（predictive）动物模型：用于发现和测定处理措施的影响，这一处理措施可以是对疾病的治疗，也可以是对化合物毒性作用的评价。新药研究,在以上三种模型系统中，在解剖学或形态学上，模型结构与研究的相关性可能是重要的优势。动物生物学结构与人类相应结构的相似程度被称为逼真度（fidelity）。当研发某一模型时，与人类情况十分类似的高逼真度的模型被认为具有明显的优势。进化程度然而，通常更重要的是模型的识别能力，尤其对于预测性模型。例如，评价某一物质的致癌性，最重要的是选择的模型动物的反应方式与人类对这一物质的反应有预测性。因此，与模型的逼真度相比，动物与人类在相关生物学机制方面的一致性通常更重要。通常模型的结构和功能的相似性是高度一致的，高逼真度为研究特定的生物学功能提供了最好的机会。,同源性（homologous）模型：动物的表型性状与人类的疾病过程一致。能够达到这些要求的模型相对较少。同形性（isomorphic）模型：动物的表型性状与人类疾病过程相似，但是引发症状的原因不同。猴艾滋病模型、猫艾滋病模型部分性（partial）模型：只有一部分表型性状与人类疾病相似，这些模型不能完全模拟人类疾病，但是可用于研究人类疾病的某些方面或对人类疾病的治疗。大部分诱发模型,人类疾病动物模型的分类,自发性（遗传性）疾病模型（Spontaneous/genetic disease models）诱发性（实验性）疾病模型 (Induced /experimental disease models)遗传修饰动物疾病模型（Gene-modified animal disease models）,三、自发性（遗传性）动物疾病模型,1. 自发性（遗传性）动物疾病模型定义 自发性动物疾病模型是指实验动物未径任何有意识的人工处置，在自然情况下所发生的疾病，为利用动物自然发生的遗传变异（突变）作为人类疾病的模型。 在长期的饲养繁殖过程中，实验动物也会患这样或者那样的疾病，有些疾病是由基因突变引起的，并能遗传给后代，经实验动物工作者将这些突变基因保持下来，培育成携带不同突变基因的实验动物品系，成为人类遗传性疾病的良好动物模型，现在已经记载和保存了数百个具有模拟人类相似疾病状态的遗传性异常的品系和品种（see, e.g., ）。,2. 自发性动物疾病模型举例,SHR大鼠1963年，日本学者Okamoto在Kyoto医学院动物室的Wistar大鼠原种中发现一只自发性高血压雄鼠，将之与该种群中另一只血压较高的雌性大鼠交配，选择子代中血压高的大鼠，以兄妹交配的方式进行繁殖，结果培育出自发性高血压大鼠(spontaneous hypertension rat, SHR)，近交至F23+代时命名为SHR大鼠。,NOD小鼠NOD小鼠1980年首次报道，是日本学者Makino等人育成的自发1型糖尿病的近交系小鼠，来源于JCR:ICR小鼠。该小鼠是在白内障易感小鼠品系的培育过程中，于近交培育到20世代时，在白内障不易感亚系的动物中发现一只雄鼠出现胰岛素依赖性糖尿病（1型糖尿病）。随后对这个亚系又进行了6个世代的近交培育，发现小鼠到30周龄1型糖尿病的累计发病率：雌性60-80%，雄性约10%。命名为NOD小鼠。NOD小鼠的临床表现与人类的1型糖尿病十分相似。在90-120日龄时突然发病，出现：高血糖、高胆固醇血症、糖尿、酮尿、多食、多尿、烦渴。与人类1型糖尿病不同之处在于，酮酸中毒相对比较温和，发病动物不经治疗也能存活1-2个月。,其它突变动物模型（近交系）裸小鼠：nu/nu突变，裸小鼠是肿瘤异种移植研究的转折点，裸小鼠首次使我们能够对自然杀伤（NK）细胞进行体内研究。肥胖症小鼠： ob/ob小鼠是1950年Jackson实验室发现的一株突变品系，来源于C57BL/6J小鼠。该小鼠是leptin基因（ob）发现的基础。糖尿病小鼠：db/db小鼠是1966年Jackson实验室发现的一个突变品系，来源于C57BLKS/J（BKS）小鼠的自发突变，该小鼠自发糖尿病。其他：施奈尔的侏儒小鼠（Snells dwarf mice），这种小鼠没有功能性的垂体；卷尾小鼠（curly-tail mouse），这种小鼠的胚胎发生广泛的神经管缺陷。还有SCID小鼠、白内障小鼠、癫痫小鼠、无毛小鼠、高脂血症小鼠、裸大鼠等。,其他突变动物模型（非近交系）BB 大鼠：加拿大Bio Breeding Laboratories于1974年育成，可自发1型糖尿病。随机交配的BB 大鼠糖尿病发病率可达90%。中国地鼠：1985年，山西医学院培育中国地鼠种群，糖尿病群体发病率约25%，近亲繁殖2-6代，发病率可达90%。Boxer犬可自发红斑狼疮和淋巴瘤。辛克莱（ Sinclair ）小型猪一个家系80%可自发皮肤黑色素瘤。,遗传改造的自发性动物疾病模型 实验动物工作者为了研究的需要，也应用遗传学方法培育一些带有突变基因或导入突变基因的品系，做为人类疾病研究的模型，这主要包括同源导入近交系和分离近交系的遗传性疾病。 例如，利用杂交和回交的方法，将nu基因导入许多不同品系的小鼠中，从而建立了具有不同遗传背景的裸小鼠的同源导入系。BALB/c-nu，Swiss-nu和NC-nu等 。,3. 对自发性动物疾病模型的评价,与人类疾病有较好的相似性。很多人类疾病的病因和发病机制远未完全清楚，而自发性动物疾病模型是动物未经人为因素处置而自然发生的疾病，弥足珍贵。 数量有限。动物本身自发的由于基因突变而发生的疾病必竟不多，而且有些疾病也不易发现，使这种模型的种类有限，多数情况下，保种和繁殖也困难，价格较贵。 有些模型实验应用较困难。有些自发性动物疾病模型使用起来也较麻烦，甚至应用有一定难度。例如，利用近交系动物自发性肿瘤模型进行治疗研究，常常要观察1年才有肿瘤发生，而且肿瘤发生的时间、种类和发生部位在个体之间常不一致，往往难于确诊和判定治疗效果。,有大量文献记述自发性动物模型，尽管已描述了许多不同种类动物的很大范围的突变种，但是它们中的绝大部分是小鼠和大鼠模型。自发性动物模型通常是同形性的（isomorphic），动物疾病的表型表现与相应的人类疾病相似。这被称作外观相似性（face validity），例如，人类I型糖尿病与BB大鼠的胰岛素依赖型糖尿病。这种表型的相似性通常扩展到模型动物对治疗的反应与人类患者相似。自发性动物模型在人类疾病治疗方案的研发方面已经起到重要作用。,近交系小鼠的大多突变都十分珍贵，因为它们同时拥有相应的同类系或同品系提供了优异的对照。因为近交系小鼠的疾病通常为一个受累基因或部位产生了变异，可同时研究与这些突变小鼠相同的遗传背景的参照品系。然而，我们应该记住，受损的基因或基因序列常常导致其他基因的激活，从而动员代偿代谢机制。这些代偿机制人类和动物模型之间可能不同。,四、诱发性（实验性）动物疾病模型,1.诱发性（实验性）动物疾病模型的定义 诱发性疾病模型是指动物的疾病是健康动物经实验因素诱发而成。通常以物理的、化学的或生物的致病因素作用于动物，造成动物组织、器官或全身一定的损害，出现某些类似人类疾病时的功能、代谢或形态结构方面的改变，以供研究用。,2、诱发性动物疾病模型举例,2.1 豚鼠哮喘模型 豚鼠过敏性支气管痉挛模型。 豚鼠肌肉注射卵蛋白4mg（4%，0.1ml），同时腹腔注射百日咳疫苗210e10/只。致敏后1314d，将豚鼠置4L的密闭玻璃罩中，用恒压（400mmHg）喷入5%卵蛋白溶液0.5分钟，也可以超声波雾化卵蛋白喷入，则豚鼠出现哮喘反应。,豚鼠药物诱发性支气管痉挛模型。 将豚鼠置于密闭的容器中，将等体积的氯化乙酰胆碱和磷酸组织胺雾化，一般用超声波雾化器，让豚鼠在密闭容器中吸入。30-50秒的潜伏期，发生明显的哮喘。,2.2 慢性肾功能不全动物模型 嘌呤霉素+单侧肾切除 体重150-200g的雄性大鼠，尾静脉注射嘌呤霉素，剂量：100-150mg/kg。常选右侧肾作单侧切除，手术在尾静脉注射嘌呤霉素1周后进行，动物逐渐发展为肾功能不全。,5/6肾切除 体重150-200g的雄性大鼠，通常选择左侧肾脏进行手术，开腹、暴露肾脏，用动脉钳钳夹肾动、静脉，阻断肾血流，以刀片或眼科剪切除左肾上下两极的肾组织，约保留1/3肾皮质，切口处以明胶海绵压紧止血。确定无出血后，放开动脉钳，缝合腹腔。 在上述手术1周后，进行右侧肾切除。则肾功能不全逐渐形成。,3.对诱发性动物疾病模型的评价,由于诱发性动物模型往往具有复制方法简便、适于研究应用等优越性，使之至今仍是医学研究中使用数量最多，应用学科最为广泛的一类动物模型。大多数诱发性动物模型是“部分性的”或“同形性的”，因为以相同的疾病病因在动物体内实验性地诱发，所获结果通常与人类对应的疾病不同。几乎没有诱发性模型完全模拟人类相应疾病的病因、病程和病理，只能部分的相似。,五、遗传修饰动物模型,在过去的二十年中，遗传工程和胚胎操作技术发展十分迅猛，从而使遗传修饰动物模型可能成为动物疾病模型的最重要内容。基因工程动物技术问世以来，已研制了大量重要疾病的动物模型，而且模型的数量还在不断地快速增长。至今，小鼠是转基因研究的最重要动物，但是，农业动物和鱼也受到了相当的关注。许多生理功能是多基因控制的，往往由不止一个基因控制，这样就需要相当大量的研究工作来确定多基因对正常和异常生理机制的影响。,伴随着小鼠和人类基因组框架图的完成，这一成果有望促进对重要疾病的病因学和遗传背景的认识。这为建立一系列新的在人类和动物之间从基因型到表型都高度一致性（构建相似性，construct validity）的动物模型铺平了道路。 这一发展还将导致动物模型应用的变化，从利用动物模型鉴定致病基因，到研究遗传过程变化的影响，基因-基因之间的相互作用和基因与环境的相互作用。,1. 遗传修饰动物的定义,遗传修饰动物是指经人工诱发突变或特定类型基因组改造建立的动物，包括：转基因动物、基因定位突变动物、诱变动物等。,2. 遗传修饰动物模型的特点,可按照研究目的进行设计和培育，其建立过程的本身就可进行疾病机制的研究。 不但能从动物整体水平和组织器官水平上进行研究，而且还可以深入到细胞水平和分子水平，为发病机制、药物筛选和临床医学研究提供了比较理想的实验体系。转基因动物技术克服了物种之间的生殖隔离，实现了动物物种之间遗传物质的交换和重组。,从理论上讲，遗传工程技术的发展，已有可能运用多种策略在体外培育的哺乳动物细胞中对任何一个或几个已知基因组结构和DNA序列的位点进行各种类型的遗传修饰。基因调控机制十分复杂，目前基因工程动物模型提供的信息还很局限。例如，利用转基因小鼠的研究证实除了单一的癌基因可以引起肿瘤外，癌基因之间的协同作用也可能导致肿瘤的发生。即导入一个癌基因可能会激活另一个癌基因，从而导致了特异性肿瘤的发生。,六、动物模型的选择应用,没有一种动物模型能完全复制人类疾病的真实情况，动物毕竟不是人体的缩影，模型试验只是一种间接性研究，只能在一个局部或几个方面与人类疾病相似，因此，模型实验结论的正确性只是相对的，最终必须在人身上得到验证。人类与其他动物的解剖和功能完全相同的假设：伽林（Galen）,生活在公元2世纪的希腊医生和哲学家，是延续几个世纪的医学权威，在西方被认为是实验生理学的奠基人。他的解剖学研究几乎完全是基于对猿猴和猪的研究，并将研究结果直接推用到到人类，导致了很多错误。直至16世纪末期。人们才开始批评伽林使用了错误的方法。,例如，豚鼠过敏性支气管痉挛模型。肌肉注射卵蛋白4mg（4%，0.1ml），同时腹腔注射百日咳疫苗21010/只。致敏后1314d，将豚鼠置4L的密闭玻璃罩中，用恒压（400mmHg）喷入5%卵蛋白溶液0.5分钟，也可以超声波雾化卵蛋白喷入，则豚鼠出现哮喘反应。此模型与人类的过敏性哮喘病临床表现相似，但对药物的敏感性却有差别，皮质醇对人的哮喘疗效较好，但对本模型的治疗作用不明显。抗组织胺药对此模型有明显的保护作用，但对人的哮喘几乎无影响。,对选择动物模型的建议,1. 全面的文献检索。 由于新的动物模型不断涌现，通常应进行彻底的文献检索来决定什么动物模型可用，哪一个模型与自己的研究最相关。已有一些很好的人类疾病动物模型的书目。此外，也有大量的关于特定研究领域模型的著作。Pubmed是一个很好的信息资源库。,2. 确定应用实验动物的种类、品种和品系。 一旦确定必须应用实验动物，则必须选择最适用的动物种类、品种和品系。研究计划的目标对选择应用的实验动物起着重要的作用。通常对于某一特定的研究难以预测哪一种生命体将出现最有用的知识和信息。,在生物学研究中，模型的选择通常从寻找高度的同源性开始，同源性被评价为有很好的相似性，通常动物进化程度越高，各器官系统与人类的同源性越高。另一方面，选择动物种类还应考虑到市场供应情况、熟悉程度和经费情况。尽管我们可以认为从一种动物获得的研究结果外推到人类时，这种动物越相似人类越好（high fidelity），但是，在以灵长类动物为基础完成的发育研究（系统发生与发育停止），并不能完全外推到人类，可成功复制AIDS的黑猩猩模型也证明了这一点。因此，关键的是疾病动物模型的病理和结果与模拟人类疾病的情况相似。因此，对许多关于人类AIDS病的研究来说，猫免疫缺陷病毒感染模型可能是一个比人类AIDS病毒感染黑猩猩更好的模型。,尽管小鼠和大鼠具有许多相同的生物学特性，但是作为人类疾病模型时它们并不一定一致。例如，可利用血吸虫实验感染小鼠研究血吸虫病，但是，血吸虫却无法诱发大鼠发病，大鼠的免疫系统能够有效地对抗血吸虫感染。例如：肠溶性药物研究投药问题；对于动态观察的反复采血问题；对于体外循环的设备解决问题；对于前期研究基础问题（人类基因修饰干细胞提供）等等。,选择动物种类的例子：血管内膜损伤后的增生在大鼠体内，以血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂预先处理，可以使颈动脉血管气囊损伤后新生内膜的增生减少80%。其他在大鼠模型中的研究也证实了以cilazapril预处理，同样的显著地减少了气囊损伤后的平滑肌细胞增生。在猪和灵长类动物血管重建术后再狭窄模型中获得的大部分资料，与那些在小动物中获得的结果相反，表现出更接近于从人类获得的资料。在猪体内，预先以血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂，cilazapril处理，未能减轻颈动脉气囊介导的深度或轻度损伤后的血管内膜肌肉增生。同样，在灵长类动物模型中应用cilazapril的ACE抑制，也不能减轻内膜切除术、气囊剥脱术或人造血管移植术后的动脉内膜增厚。,3. 选择经典动物疾病模型在整个动物王国中，特别是哺乳动物，为许多特定的人类疾病提供了高度针对性的模型。例如，豚鼠对于哮喘和过敏反应、家兔对于发热、沙鼠的先天脑血管缺陷、小型猪的动脉粥样硬化等等，这些一对一的模型的应用在理解和控制疾病中已经带来了很多益处，而且有望在生物医学研究中继续提供重要信息。例，Wistar大鼠和BN大鼠的过敏性鼻炎 由于哺乳动物在结构和功能方面与人类明显的相似性，它们已被广泛应用。大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠得到大量应用是因为他们体形小、生命周期短、便于操作和高生产率，同时得以标准化和丰富的市场供应。,在选择动物模型时要考虑的因素,作为类比动物的相似性信息的可移植性可应用的生命个体的遗传一致性生物学特性的背景资料可用性和价格结果的可推广性实验操作的简便性和适用性,生态学结果是否涉及伦理问题饲养的适用性动物体型的大小所需动物数量寿命性别所需资料的数量动物年龄等,4. 与有经验的人进行讨论当选定了一个动物模型，如果研究者本人对这个模型不熟悉，他应该与一个有经验的人进行讨论。这个人可能通过出版物或网上的资料来寻找。与熟悉模型的人进行的讨论可提供很有帮助的信息和建议，而这些通常在任何出版物中是不能发现的。例，大鼠失血性休克一旦最适用的动物模型被确定，就要考虑动物的饲养和观察，需要确定是否有必需的设施和饲养空间。进而，每一个与动物打交道的人必须花费时间来学习和理解所选择动物种类、品种和品系的特性。,七、从动物到人类的推测（Extrapolation）,当从动物模型中产生了实验结果，人们希望在所模拟的动物种类中也是有效的，这种模拟的动物种类通常是人类。 “外推”通常用于描述怎样将从动物获得的资料可靠地应用于人类