类风湿与抗环状瓜氨酸抗体

,抗环瓜氨酸肽抗体检测及临床应用,抗环瓜氨酸肽抗体,抗环瓜氨酸肽 (cyclic citrullinated peptide CCP）抗体是由类风湿关节炎(RA)患者B淋巴细胞分泌的特异性较高的抗体 ,其他疾病和正 常人群的B淋巴细胞不分泌CCP抗体，2000年Schellekens等首先将其用于RA的检验诊断。,抗环瓜氨酸肽抗体检测及临床应用,Definition of RA and RF,类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种病因未明的慢性炎症性系统性疾病.主要侵犯人体各滑膜的关节,但以腕关节、掌指关节以及近端只指间关节最易受累.RA患者血清类风湿因子常呈阳性反应，并有关节外的全身表现RA的基本病理改变是关节滑膜的炎症以及随之出现的滑膜增生，严重者形成“血管翳”样改变，继而侵犯软骨、软骨下骨和韧带，引起关节破坏畸形和功能丧失,Diagnosis of RA,1987年美国风湿病学会修订的标准 晨僵持续时间至少1小时(病程6周) 3组或3组以上关节炎(病程6周) 腕掌指关节或近端指关节肿胀(病程6周) 对称性关节肿胀(病程6周) 类风湿性皮下结节 手部腕部X线改变(骨侵蚀或关节周围骨减少) 类风湿因子阳性(滴度:32)符合上述7条中的4条，就有可能患有RA该分类标准的敏感度为92%,Picture of RA,X-ray picture of RA patient,类风湿关节炎的血清学检测标记物,类风湿因子 抗核周因子 抗角蛋白抗体 抗聚角蛋白微丝蛋白抗体 抗Sa抗体 抗RA33/36抗体 抗环瓜氨酸肽抗体,类风湿因子（RF）,RF是一种抗变性IgG分子Fc段的自身抗体，可分为IgM、IgG和IgA三种类型，常见于RA患者的血清和滑液中，一直以来是RA诊断的标准之一，目前仍是多数医院最常用的诊断RA的辅佐检测项目。血清中RF阳性的RA患者常有病情活动，关节骨质破坏较多且严重。与其它的标志物相比，RF诊断RA的敏感性较高（68.5%），但与其他风湿病相鉴别的特异性较低（77.1%），除了RA的其他结缔组织病、慢性感染性疾病也可检出RF，甚至健康人也有25的阳性率。,抗核周因子（anti-perinuclearfactor，APF）,APF是1964年Nienhuis在RA血清中发现的一种抗人颊黏膜细胞浆内角质蛋白颗粒的抗体。抗核周因子主要为IgG，也含有IgM及IgA成分。APF是以人的颊粘膜上皮细胞作为底物，采用间接免疫荧光法测定。抗核周因子与类风湿关节炎有明显的相关性，不仅敏感性高（49%91%），特异性也好（73%99%）。APF阳性、RF阴性的类风湿关节炎病人往往预后较差。,抗角蛋白抗体(anti-keratinantibody，AKA),1979年Young等发现RA血清中有一种能与鼠食管角质层反应的抗体，并对RA具有特异性，命名为AKA。AKA以Wistar大鼠食管角质层为底物，采用间接免疫荧光法测定。AKA的诊断敏感性为36%59%，特异性88%99%。它可以在RA发病以前若干年出现，所以有早期诊断价值。,抗聚角蛋白微丝蛋白抗体(anti-filaggrinantibody，AFA),1993年，Simon等从正常人乳房表皮中提取聚角蛋白微丝蛋白（filaggrin），应用免疫印迹法(IB)在75的RA中检出AFA。检测结果表明，RA的多种自身抗体中，AFA对于早期RA诊断的阳性预测值和阴性预测值明显高于APF、AKA，并且AFA阳性率在超早期RA中有增高趋势，与疾病活动性和严重度无关，结果上看，AFA对早期RA的诊断价值优于其他自身抗体。,抗Sa抗体,1994年Despres等首次报道从人脾脏中提取Sa抗原，应用蛋白质免疫印迹法在42.7%RA患者中检测出抗Sa抗体，特异性高达98.9%，且病程小于1年者的阳性率为29%。Menard等认为，Sa抗原是瓜氨酸化的波形蛋白（vimentin）。Sa抗原也可由人胎盘提取，应用免疫印迹法检测抗Sa抗体，出现50kD和(或)55kD显色条带为阳性。抗Sa抗体与患者的年龄、性别无关，与疾病活动性正相关，可以为疾病活动性和疗效评价提供依据。,抗RA33/36抗体,自1989年Hassfeld等用免疫印迹法(IBT)在约36的RA患者血清中检测到RA33/36抗体后，大量学者致力于RA33/36的研究。抗RA33抗体是分子量为33kD的一种胞核蛋白抗体，也是RA的特异性血清学诊断指标，具有较好的敏感度和特异性（99.6%），在确诊RA之前抗RA33抗体就可为阳性，对于RA的早期诊断很有价值。RA33/36抗原可来源于Ehrlieh细胞或Hela细胞，应用免疫印迹法检测抗RA33/36抗体。,抗环瓜氨酸肽抗体,2000年，Schellekens等根据聚角蛋白微丝蛋白的cDNA序列人工合成了一种环化肽，即环瓜氨酸肽(CCP)，以此CCP为抗原，建立酶联免疫吸附试验（ELISA），在RA血清中检测出抗CCP抗体。结果表明，早期关节炎症状患者的抗CCP抗体在RA早期可出现阳性，其特异性达96%，高于RF，阳性预测值为84%。进一步研究发现，抗CCP抗体先于临床症状而存在，约39%的患者先于临床症状5.3年（均值）存在抗CCP抗体，而且到症状出现时其阳性率逐渐增加。抗CCP抗体诊断RA具有满意的敏感性和特异性，对RA的早期诊断、鉴别诊断和预后评估都有重要意义。抗CCP抗体与APF、AKA、以及HLA-DR4之间有一定相关性。,ESR与CRP,RA患者处于疾病活动期时，常常伴有红细胞沉降率增快和血清C反应蛋白试验阳性。所以，这两项实验检查对评价RA病情有一定帮助。,抗CCP抗体的检测,酶联免疫吸附法（ELISA） 荧光酶免疫法（ELIA）化学发光酶免疫法（CLEIA）,抗CCP抗体的检测,抗CCP抗体最常用的检测方法是间接ELISA法，即以人工制备的环瓜氨酸肽包被酶标板，加入检样后，再加入酶标记抗人IgG，最后用酶底物显色。此外，利用荧光或化学发光等方法检测抗CCP抗体，可以使检测程序自动化，检测时间也大大缩短。,酶联免疫吸附法（ELISA）,第一代抗CCP抗体试剂1998年Schellkens，人工合成920个氨基酸残基的含有瓜氨酸残基的直链线性短肽，即瓜氨酸肽，经ELISA筛选出具有抗原性的片段。以此瓜氨酸肽作为抗原基质，在RA血清中用ELISA法检测出抗瓜氨酸肽抗体，结果显示该抗体可在76%的RA中检测出，特异性为96%。2000年，Schellekens等将人工合成的一条由19个氨基酸残基组成的瓜氨酸肽中的2个丝氨酸替换为半胱氨酸，形成与-转角具有相似结构的二硫键，形成环瓜氨酸肽。用ELISA法检测RA的抗CCP抗体，敏感性较用直链线性肽为抗原有明显提高，分别为68%和49%，两者的特异性相似，为98%和96%。此为第一代抗CCP抗体诊断试剂。,酶联免疫吸附法（ELISA）,第二代抗CCP抗体试剂随着关节滑膜液中瓜氨酸化自身抗原的不断发现，患者体液中也存在着大量相应的异质性自身抗体，故单独的瓜氨酸化抗原或多肽不能本质提高临床检测的特异性和敏感度（与RF相比）。根据瓜氨酸与精氨酸结构特征，以及其侧翼氨基酸序列的组成，应用生物信息学相关软件预测其空间结构变化，对已知的瓜氨酸化抗原分析、分类，筛选出含有瓜氨酸的多肽文库。通过将含有瓜氨酸的多肽库与类风湿关节炎血清筛选得到与filaggrin无关的CCP，其具有更有利于抗体检测的表位，即为第二代CCP。CCP2不仅保持了较高特异性(97%)，而且其分析敏感度也有显著的提高（CCP142%，CCP254%），关节损害程度大的患者抗CCP2抗体阳性的检出率也高。,酶联免疫吸附法（ELISA）,第三代抗CCP抗体试剂第三代抗CCP抗体诊断试剂于2005年推出，在它的合成CCP抗原中增加了不能被抗CCP2抗体识别的瓜氨酸抗原决定簇，敏感度有了略微的提高。BizzaroN等人和LutteriL等人分别针对现在市场上使用的第二代和第三代CCP试剂盒（Kit）进行了比较，伊诺瓦诊断（InovaDiagnostics）公司开发的三种检测方法中，其CCP3试剂盒与使用CCP2为抗原的方法相比仅仅略有改善，敏感度分别为67%和64%。,荧光酶免疫法（ELIA）,2005年Herold等将第二代CCP抗原用荧光酶免疫法（ELIA）检测抗CCP抗体，并与ELISA法比较，试图建立全自动的抗CCP抗体检测方法。这种测定方法容易操作，节约时间，而没有降低试剂性能，其敏感度达80%，特异性为97%，应用前景好。后来Dubois-Galopin等也对该测试系统进行评估，与ELISA法比较发现，测定值与抗CCP抗体浓度之间呈现良好相关性。,化学发光酶免疫法（CLEIA）,化学发光酶免疫法是利用酶催化的化学发光，将记录的光子数转换成被检测物的含量的一种测定方法。与ELISA方法比较，其特点是完全自动化操作，测定范围宽，用时少。首先将CCP抗原结合到磁珠上，样品与CCP结合，利用磁场收集抗原-抗体复合物，然后这种复合物与碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体结合，最后将化学发光的底物（如APS-5）加入其中，检测光子数。实验表明，CLEIA法具有与ELISA法一样高的敏感性和特异性，检测范围可达后者的十倍，而且45分钟可出结果，而ELISA则需3小时左右。,CCP抗体在 RA发病机制中的作用,1.在关节滑膜的自身免疫性炎症中。中性粒细胞等炎性细胞首先在细胞黏附分子的作用下，经历了翻滚、黏附、渗出、浸润等过程，中性粒细胞、树突状细胞及巨噬细胞被激活 ，并产生多种炎性介质 ，如肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素 (IL)、干扰素 (IFN)、生长因子(GFs)等，使滑膜红肿及滑膜微血管系统失衡，微循环紊乱促使大量炎性细胞进入滑膜腔，还可导致缺氧甚至使滑膜组 织微梗死。同时，纤维蛋白原 自微血管漏 出，形成衬于血管外的纤维蛋白网。此外 ，微循环紊乱也可导致氧过剩 ，其后产生的活性氧也可造成自由基损 伤，进而引起炎性细胞死亡。,CCP抗体在 RA发病机制中的作用,2.炎性细胞内的蛋白属于瓜氨酸系列 ，如巨噬细胞的 vimentin样蛋白及中性粒细胞中的组蛋白，能够渗漏出细胞至关节滑膜中；此外 ，细胞外蛋白如渗出至血管外的纤维蛋白，也可被凋亡或坏死细胞释放的多肽精氨 酸 脱 亚 氨 酶（PAD）瓜氨酸化，均生成大量瓜氨酸。瓜氨酸蛋白暴露于免疫系统 ，给遗传因子和启动信号以适宜条件 ，导致B淋巴细胞 产生抗CCP抗体 ，发生炎性反应 。,CCP抗体在 RA发病机制中的作用,3.新生成的瓜氨酸蛋白与抗 CCP抗体通过炎性细胞的 Fc7受体形成免疫复合物，免疫复合物又进一步引起细胞的活化 ，使激活的细胞产生新的细胞因子 ，从而使滑膜中维持高浓度的炎性介质，使炎症过程继续发展 ，形成病理性恶性循环 ，最终导致关节的不可逆损伤 。,抗 CCP抗体的临床应用,1.抗 CCP抗体是 RA早期诊断较理想的检测指标,RA是致畸率高、后果严重、常见的自身免疫病，全世界约1%的人群患本病 ，发病 2年内即可出现不可逆的骨关节损伤，并可引起心血管、神经等多系统损害，给患者带来极大痛苦，也给社会造成沉重的负担，早期诊断及治疗是控制病情的关键。现行的实验室诊断主要靠检测 RF，但3 5 % 的正常人群可以检测到 RF，在结缔组织病、感染、肿瘤等疾病中 RF也可为阳性。,抗 CCP抗体是 RA早期诊断较理想的检测指标,抗CCP抗体对类风湿关节炎诊断的特异性敏感性高，与类风湿因子的诊断敏感性相当，但特异性更高，与抗核周因子抗体的特异性相当，而敏感性更高。虽然抗CCP抗体、抗核周因子、抗角蛋白抗体与类风湿因子有较高的一致性，但不能相互替代，如果同时检测这4种抗体，能进一步提高诊断的特异性。该抗体可先于疾病的临床表现出现，因此可预测患者从一般关节炎向类风湿关节炎发展。它对类风湿关节炎预测的敏感性为73. 3 %，特异性为92. 6 % ,阳性和阴性预测值分别为91. 7 %和75. 7 %，优于类风湿因子和抗核周因子抗体。,2.防止漏检，与RF联合使用可确认RA,3.性能优越,敏感性达到80%特异性达到96%,4.提示预后,1.预示疾病发展具有侵蚀性的强相关指标：其阳性往往提示预后欠佳，易出现或已出现骨侵蚀性破坏，是RA疾病严重性的指标。近年来有研究发现，抗CCP 抗体阳性的类风湿关节炎患者的骨破坏比阴性患者更严重,抗CCP抗体的含量与类风湿关节炎的病情严重程度及发展有关。浓度的高低可有助于判断预后，浓度高往往提示预后不佳，发生关节侵蚀的危险大。,2. 抗 CCP抗体检测对判断 R A病情及估计预后具有参考价值多数研究资料表明，抗 CCP抗体阳性反映病情活动，与关节发生侵蚀性病变具有密切关系，这也符合CCP抗原抗体复合物作为RA发病重要环节的病理生理理论。Kroot等对数百例 RA患者进行l6年的随访，通过影像学评分的连续观察指出，抗 CCP抗体阳性患者较阴性患者更易发展成影像学可见的关节损害，也就是说，抗CCP抗体阳性患者发展为侵袭性疾病的可能性更大 。,5.助于确诊,7.鉴别诊断,适用于鉴别诊断RA与其他炎症性关节炎和其他形式的多关节炎（EB病毒感染者、丙肝病毒感染者、细小病毒感染者、骨关节炎患者）可协助鉴别有关节炎表现的HCV感染者与RA,7.指导治疗,在治疗方案上，与CCP抗体低浓度的RA患者相比，高浓度CCP的RA患者，往往对肿瘤坏子因子拮抗剂的治疗不敏感。,指导治疗,以色列r