实验二通课2012-3-2

内 容 提 要,家兔发热法 烦琐、灵敏度不高 鲎试验法 操作简便、灵敏度高，可检测小于10ng/ml 的内毒素。,一、内毒素（LPS）的检测（1.5学时）,目 的,掌握内毒素检测的方法及临床意义。,临床意义,1.检测输液用品或生物制品中是否含有 内毒素。,2.检测患者是否有革兰氏阴性菌感染引起的内毒素血症（内毒素休克）等。,原 理,鲎（hu）是一种海洋节肢动物，其血液中含有一种有核变形细胞，这种细胞的胞浆中含有凝固酶原和凝固蛋白原。,材 料,鲎试剂鲎试剂溶解水内毒素试剂 无菌注射器,方法及结果,方法： 1.取两支鲎试剂打开，分别加入0.1ml 鲎试剂溶解水， 振摇使之完全溶解。 2.其中一支加入0.1ml内毒素，标记为实验组， 另一支加入0.1ml溶解水，标记为对照组。 3.垂直放入37温箱，20-30分钟观察结果。结果： 实验组出现凝固，对照组不出现凝固,二. 肠道致病菌的分离培养（1.5学时）,病原菌的检验程序,粪 便增菌培养（必要时） SS 培养基 革兰染色 双糖铁培养基 生化反应血清学鉴定,肠道杆菌的鉴定程序,1、材料,粪便、ss平板接种环和酒精灯等。,粪便中病原菌的分离,2、方法 将粪便标本以分区划线法接种到SS培养基，放入37温箱中培养24小时。取出 放4 冰箱中保存备用,内 容 提 要,肠道杆菌的生物学性状,埃希菌属：大肠埃希菌沙门菌属：伤寒沙门菌 甲型、乙型副伤寒沙门菌志贺菌属：痢疾志贺菌,肠杆菌科重要菌属及代表菌种,大肠杆菌: 生物学性状: G- 镜下为杆状营养要求不高,可在普通琼脂培养基上生长最适宜温度为37度,最适宜pH为7.4,肠道杆菌的生物学性状,菌落特点： 圆形，凸起，灰白色，表面光滑，湿润，直径2-3mm。,伤寒杆菌生物学特性: G-镜下为杆状营养要求不高,可在普通琼脂培养基上生长最适宜温度为37度,最适宜pH为7.4,肠道杆菌的生物学性状,菌落特点: 圆形,凸起,无色透明, 中等大小。,1、相似的形态染色从形态上无法区别,中等大小的G-杆菌,多有鞭毛、菌毛,肠道杆菌的生物学性状,2、活泼的生化反应,肠道杆菌的生物学性状,乳糖发酵试验,肠道杆菌的生物学性状,2、活泼的生化反应,二、肠道致病菌的分离培养,SS培养基,胆盐抑制G+,枸橼酸钠和煌绿能抑制大肠杆菌,致病的沙门菌和志贺菌能大量生长。中性红指示剂和乳糖,中性红遇酸变粉红。常用于培养肠道致病菌。,常见培养基的特性,SS平板大肠杆菌 粉红色大菌落痢疾杆菌 无色细小 半透明菌落伤寒杆菌 无色细小 半透明菌落,常见培养基的特性,双糖铁培养基上各菌的生长特点,含有乳糖和葡萄糖：产酸产气含有硫酸亚铁：如细菌分解含硫氨基酸生成 硫化氢，可形成黑色沉淀酚红指示剂： 酸：黄 碱：红,1)大肠杆菌发酵乳糖和葡萄糖产酸产气（糖发酵试验），是斜面及底层均呈黄色并有气泡。2) 沙门菌和志贺菌只发酵葡萄糖，不发酵乳糖，分解葡萄糖产的酸使培养基pH下降，酚红指示剂变黄，但是培养基中的葡萄糖仅有0.1%，在斜面的酸性物质被氧化成挥发性酸，而底层则为黄色。,双糖铁培养基上各菌的生长现象,将粪便标本以分区划线法接种到SS培养基。 (每个实验室8个平板）(接种好后，做好标记，用胶布按班绑好) 放入37温箱中培养24小时。取出放4冰 箱中保存备用。,分离培养方法,三、消毒灭菌及细菌的分布（2学时）,1. 高压蒸汽灭菌法,2. 细菌在自然界的分布及理化因素对细菌的影响,1.空气中细菌的检查（每个班1个平皿） 原理：根据空气中携带有微生物气溶胶（以固体或液体微小颗粒分散于空气中的分散体系称为气溶胶，其中的气体是分散介质）粒子在地心引力的作用下，以垂直的自然方式沉降到琼脂培养基上。 方法：在室内选择一处放一个平皿。揭开皿盖，皿盖扣置于皿底下，暴露放置15min，即盖上皿盖，放入37 培养24小时，观察结果。,细菌在自然界的分布,2. 咽喉部细菌的检查（每班2个平皿） 取血琼脂平板1块，打开平皿盖，将培养基面置于口腔前10cm处，受试者用力咳嗽几次；盖上平皿盖，置37温箱中倒置培养24h后取出观察结果。,细菌在自然界的分布,体表细菌的检查,方法：取一普通平皿培养基，一部分写上“前”，另一部分写上“后”，然后将手指在写有“前”的部分沾一下，再将手指用酒精进行消毒，在写有“后”的部分沾一下。放入37温箱培养24小时后观察。,（每个实验室4个平皿）,高压蒸汽灭菌法,注意事项：,锅内物品不宜过紧。 注意排出冷气，否则气压表虽已达15磅，温度 达不到121.3，不能保证灭菌效果。 灭菌后排气不能过急，以免容器内液体外溢或 引起破裂。 不耐高热高压之物品，不能用此法。,紫外线杀菌作用强，而穿透能力弱。紫外线中波长为200-300nm者具有杀菌能力，其中265-266nm的杀菌作用最强。杀菌机制：引起DNA链上相邻的胸腺嘧啶形成二聚体，从而干扰DNA的复制和转录，导致细菌死亡。,紫外线对细菌的影响,紫外线对细菌的影响（每个实验室1个培养皿）,取一个平皿，用密涂法将细菌涂布于培养皿中，打开一半平皿盖，置于紫外灯下照射30分钟，然后盖好平皿，置37培养24h后取出观察结果。,密涂接种,分三次接种，每次取一环。第一次密涂接种后旋转60度二次密涂接种，然后同方向旋转60度后再次密涂接种。,有些化学药品浓度高时能杀灭病原微生物， 称为化学消毒剂； 浓度低时能抑制细菌生长，称为防腐剂； 只能外用，对细菌的敏感性不同。,化学消毒剂对细菌的影响,化学消毒剂对细菌的影响,方法：取一普通平皿培养基，一部分写上“前”，另一部分写上“后”，然后将手指在写有“前”的部分沾一下，再将手指用酒精进行消毒，在写有“后”的部分沾一下。放入37温箱培养24小时后观察。,（每个实验室4个平皿）,实验二通课,鲎试验（两人一支）肠道致病菌分离培养 S-S培养基8个/室为避免分离不到细菌，每个实验室用4个S-S培养基接种大肠杆菌，另外4个接种粪便。细菌的分布与消毒灭菌1. 空气、咽喉部、手指、紫外线 (其中血平板2个