实验1大肠杆菌的培养和分离2013-9-11emma

定义:结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有细胞结构的低等生物，包括病毒、原核生物(细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、衣原体)、原生生物(最简单的真核生物)和某些真菌（酵母菌、霉菌）。,微生物,显微镜,功能（1）放线菌和霉菌中提取抗生素 （2）酵母菌发酵酿酒 （3）乳酸菌发酵制作泡菜 （4）醋酸菌发酵制作醋 （5）红曲霉和毛霉发酵制作腐乳 （6）微生物用于治理环境,菌落(子细胞群体),单,菌落：由单个细菌（或其他微生物）在适宜固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度；形成肉眼可见有一定形态结构等特征的子细胞的群落。,不同微生物形成的菌落具有不同的特征（形态、突起、边缘），是鉴定菌种的重要依据。,大肠杆菌（E.coli）,分布：人和哺乳动物肠道，此外还广泛分布于水、 污水、土壤、谷类、乳制品等当中。,大肠杆菌在人体的_中一般对人体无害，但任何大肠杆菌如果进入_都会对人体产生危害。大肠杆菌是_工程中被广泛采用的工具。,肠道,泌尿系统,基因,革兰氏_（填阴或阳）性菌,阴,代谢类型：,异养，兼性厌氧型,生长适宜温度：,质粒、,EcoR限制酶、,E.coli-DNA连接酶、,受体细胞,37左右,大肠杆菌的培养和分离,1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作2.进行大肠杆菌的分离,用固体平板培养基进行细菌的划线培养3.说明大肠杆菌培养的条件和操作要求的原理,实验目的,LB液体（固体）培养基,一、配制培养基,培养基：是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养液。,水、碳源、氮源、无机盐、生长因子,(生长因子即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶),1、成分,区别于动物培养与植物培养：不加激素,固体培养基与液体培养基的区别：琼脂,如NaCl,一、配制培养基,不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方,实例： “细菌喜荤，霉菌喜素”,细菌培养基要用蛋白胨和酵母提取物来配制，还要加入一定的氯化钠，以维持一定的渗透压；霉菌培养基一般用无机物配制或添加蔗糖的豆芽汁,调节pH,真菌：56 细菌：6.5 7.5,二、包器材,封口膜通空气不通细菌,牛皮纸或报纸,加盖后几个包在一起,接种环包牛皮纸,P20,分装：注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，因此在将培养基转移到三角瓶或试管中时必须用_。加塞：试管用塑料盖或_；三角瓶口用_ 或_封口,再用_或报纸封口。包扎：用_或报纸,三角漏斗,棉花塞,封口膜,6层纱布,牛皮纸,牛皮纸,250ml装50ml,三、灭菌,定义：以化学剂或物理方法消灭所有微生物（包括芽孢(休眠体)和孢子（真菌、放线菌生殖细胞）,方法1：高压蒸汽灭菌：100kPa、121 下维持15min（培养基、无菌水、玻璃器皿等灭菌。P20），灭菌前排出锅内冷空气，因为空气膨胀压大于水蒸气膨胀压，达不到水蒸气的温度。灭菌锅压力与大气压相同时打开锅盖,灭菌后，通常将实验用具放进6080的烘箱中烘干，除去灭菌时的水分，防止污染(P20),方法2：干热灭菌：160-170 下加热1-2h。玻璃器皿等耐热器具,恶劣环境下,四、超净台操作,无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止_污染（培养基和操作者）的方法。,杂菌,1、紫外消毒（针对空气）：实验用具放在超净台上，打开超净台的紫外灯和过滤风（人离开）30min左右，培养基冷却至60，关闭紫外。,2、酒精消毒：用镊子取出酒精棉擦拭超净台桌面，并擦拭双手。,3、开始实验,灭菌与消毒的区别,灭菌与消毒的区别,消毒：使用较温和理化因素，仅杀死物体表面或内部的一部分对人体有害的微生物的过程。不能杀死芽孢和孢子。（对被消毒物体基本无害）,灭菌：使用强烈的理化因素消灭物体内外所有微生物，包括芽孢和孢子。（细菌蛋白质变性达到灭菌目的）,例题：请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1） 培养细菌用的培养基与培养皿（2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管（3） 实验操作者的双手,答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。,高压蒸汽灭菌,干热灭菌,灼烧灭菌,紫外线消毒法（使蛋白质变性，还能损伤,化学药剂消毒法（酒精）,煮沸消毒法,400500,70%,DNA结构,巴氏消毒法,四、超净台操作,倒平板,制斜面：冰箱4保存单菌落,在酒精灯火焰旁，以右手无名指及小指夹持封口膜，右手其他三个手指拿着三角瓶；左手拿着培养皿，并打开上盖的一边，将三角瓶中培养基（1020ml）倒在培养皿里，将其放于水平位置，轻轻晃动，使培养基铺满底部，凝固形成平面。倒置放置既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染.,试管斜面培养基密闭效果比平面的好很多,不容易进入杂菌，同时能用来做纯细菌的长期保存。,思考题：A、操作过程中避免带入杂菌的方法有哪些？1、灭菌后的培养基、器具置于超净台上，并打开超净台的紫外灯和过滤风，灭菌30分钟。2、用镊子夹出洒精棉球擦拭桌面和实验者双手。3、整个操作在酒精灯火焰旁进行4、打开后或加塞前试管口、三角瓶口灼烧灭菌。,B、培养基灭菌后，需要冷却到60后才倒平板，你用什么办法来估计培养基的温度呢？可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。,思考题,C、在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。,D、如何检查培养基是否受杂菌的污染？将未接种的培养基放在恒温箱中培养，若无菌落产生则未受杂菌污染。,四、超净台操作,接种扩大培养,从大肠杆菌斜面锥形瓶中的液体培养基接种好后在37度摇床振荡培养12h,注意事项:1.火焰旁从斜面上用接种环取菌;2.取菌前接种环要用酒精灯灼烧灭菌,冷却后方能取菌;3.取菌后封口膜和棉塞复原.,四、超净台操作,划线分离法,首,尾,注意事项:1.接种环灼烧灭菌后要冷却，避免温度高杀死菌种1.接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次,不能划破培养基.2.划线首尾不能相接3.划线后,培养皿倒置培养37，1224h,第一区域,第二区域,第三区域,第四区域,第五区域,注意1:不能出现线条的重叠,注意2:第二次或随后几次的操作总是从上一次划线的末端开始,注意3:最后一个区域不能与第一个区域相连,平板划线接种,灼烧接种环,冷却,划线 （第一区域）,蘸取菌液,灼烧接种环,冷却,划线 （第二区域）,灼烧接种环,冷却,划线 （第三区域）,灼烧接种环,冷却,划线 （第四区域）,灼烧接种环,冷却,划线 （第五区域）,灼烧接种环,平板倒置放置培养,在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,单菌落分离的标志？,划线的末端出现不连续的单个菌落,为什么要倒置培养？,既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成细菌随水扩散污染，难以分成单菌落，达不到分离的目的,1、系列稀释操作,四、超净台操作,涂布分离法,2、涂布平板操作,玻璃刮刀,细菌的分离方法,划线分离法，简单方便；涂布分离法，单菌落更易分开，但操作复杂些,单菌落培养,试管斜面培养基密闭效果比平面的好很多,不容易进入杂菌，同时能用来做纯细菌的长期保存。,在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在斜面上，37培养24h后，置于4冰箱中保存,分析与讨论:1、如何操作才可以尽量避免被杂菌污染？,（1）胆大心细，操作快捷（2）注意灭菌操作原则，灭菌要彻底，尽量降低环境污染几率，手和实验服要保持清洁，合理地减少操作时间，对污染源的改善要考虑周到（3）注意微生物的生长条件，如pH、渗透压、温度等。细菌喜中性偏碱性环境，喜蛋白质丰富的物质营养，喜37的温度；而霉菌喜中性偏酸性环境，喜糖类丰富的物质营养，喜25-30的温度。,不仅考虑培养基成分，也要考虑理化性质：pH、渗透压、温度、氧气等,分析与讨论:2、在培养后如何判断是否有杂菌污染？,（1）从菌落的形态看，是否湿润、透明、黏稠，呈何种颜色等，是区别细菌、酵母菌、放线菌和霉菌的关键指标（2）用显微镜镜检观察其形态、大小，看是否有菌丝、孢子、芽孢等，这也是区别细菌、酵母菌、放线菌和霉菌的关键指标（3）上述方法较难区分同类的不同菌种，这时就需要借助化学方法和进一步的形态观察，如用革兰氏染色法，观察孢子形态、孢子着生方式、菌丝生长方式、有无鞭毛、芽孢、毒素及特异生理生化性质等,分析与讨论:3、实验完成后，接触过细菌的器皿应如何处理？,完成实验后，所有接触过细菌的器皿都必须先经过高压灭菌后再洗涤，特别是培养基有可能被有害菌体污染，在培养繁殖后，大量有害菌体会影响人畜健康，也会污染环境，因此必须高压灭菌。使用后的废弃物也要经过高压灭菌后再丢弃。对于取样器的取样头，通常是灭菌后在超声波清洗器中加洗衣粉洗涤30min，再永清水洗净，仍可再用。封口膜也可重复使用。,分析与讨论:4、如果分离的是转基因的大肠杆菌，如何保证不被普通的大肠杆菌所污染？,转基因用的质粒，不是细菌中原有的质粒，而是通过改造的，通常加入了抗性基因的DNA序列，如抗氨苄青霉素基因。转基因载体（质粒）转化进入大肠杆菌后，能在含有氨苄青霉素的培养基中生长，而未被转化的就不能生长，其它没有抗氨苄青霉素基因的杂菌也不能生长，这种设计保证了转基因工程菌的纯洁性。在获得转基因工程菌后，如果为了选择高表达量菌株等进行分离，也可使用含抗生素的培养基，这就保证了转基因工程菌不被普通（无抗性基因）的大肠杆菌所污染。,请回答下列酵母菌有关的问题：（1）从生态系统的成分上看，酵母菌属于 ，它的同化作用类型是 。（2）培养酵母菌时，为防止杂菌污染需要对培养基和培养皿进行 。（3）酵母菌菌种A能耐高温，但产酒精率较低，而菌种B不耐高温，产酒精率却较高。利用细胞工程课获得耐高温、产酒精率高的融合子酵母菌（目的菌种），利用A、B两菌种对某一药物抗药性的差异，可对融合子进行筛选。实验中，应将含有融合子的培养液利用 方法接种到含有相关药物的基本培养基上。下表为A、B两菌种在几种药物的作用下，生长状况的实验结果。由于A种不能独立在基本培养基上生长，所以，据表可以判断，加