不同移植途径对人骨髓间充质干细胞治疗大鼠脑缺血卒中的归巢行为及疗效的影响

不同移植途径对人骨髓间充质干细胞治疗大鼠脑缺血卒中的归巢行为及疗效的影响,杜世伟 副主任医师、博士武警总医院 神经血管外科,背 景,脑血管疾病是临床常见的高致残率、致死率的疾病缺血性脑血管病在我国占到全部脑血管病的70左右 临床治疗没有十分有效的治疗措施， 干细胞治疗临床前研究结果令人鼓舞,脑缺血卒中后动态病理变化,Frank C Barone ,Giora Z Feuerstein.Inflammatory Mediators and Stroke: New Opportunities for Novel Therapeutics.Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism,1999, 19:819834,干细胞治疗缺血脑卒中比较公认的机制,抗凋亡作用神经营养血管新生自身神经干细胞激活免疫调理促进脑功能重塑等,干细胞归巢机制,归巢性是hBMSCs 重要的特点之一,基质细胞衍生因子-1与其受体 CXCR4 信号转导系统对 hBMSCs 特异的归巢到脑梗死及缺血半暗带区域起到重要作用,Eric M. Green,Richard T. LeeProteins and Small Molecules for Cellular Regenerative Medicine. Physiol Rev. 2013 Jan; 93(1): 311325.,临床应用前所面临的问题,病人选择治疗时间窗选择治疗途径的选择*相关机制研究*,研究内容,不同移植途径对人骨髓间充质干细胞治疗大鼠脑缺血卒中的归巢行为的影响不同移植途径对人骨髓间充质干细胞治疗大鼠脑缺血卒中的疗效的影响,研究目的,建立动物模型，模拟临床移植方式：颈动脉、股静脉、脑实质、脑室、腰蛛网膜下腔移植观察移植途径对骨髓间充质干细胞治疗效果影响探讨其作用机制筛选适合临床需要的移植途径,实验分组,大鼠大脑中动脉缺血再灌注后24h对大鼠进行改良神经功能损害评分，选择mNSS评分为10-14分大鼠进行分组： A组：颈内动脉移植（1ml，1106 ） B组：股静脉移植（1ml，1106 ） C组：立体定向脑内移植（纹状体）（10ul，1106 ） D组：立体定向左侧脑室内移植（10ul，1106 ） E组：腰蛛网膜下腔移植（10ul，1106 ） F组：对照组,检测指标,人骨髓间充质干细胞的迁移分布：HuN行为学梗塞面积测定：HE神经元凋亡：NeuN、Bcl-2、Bax神经功能重塑：PSD-95、Synaptophysin,迁移分布,神经损害评分和粘贴物移除实验,线图显示各种途径移植干细胞治疗后神经损害评分和粘贴物移除实验变化趋势，细胞治疗在移植后都有一定的治疗效果，其中A、B、C组动物在移植后1周至4周功能恢复明显（P0.05），E组与F组比较第四周时未见明显差异，D组效果介于以上之间,相对梗死体积,各种途径移植后4周各组的相对梗死体积情况。其中ABCD组与对照组F比较均有显著差异，E组与F组在之间比较未见明显差异，但总体上仍有改善（* vs. F组 p0.05）,梗塞灶周围皮层神经元细胞计数,梗塞灶周围皮层神经元细胞计数。脑缺血后梗塞灶周围大量神经元凋亡，骨髓间充质干细胞移植后可增加梗塞灶周围神经元存活数量，AB组与F组比较有显著差异，CDE组与F组比较未见明显差异（* vs. F组 p0.05）,皮层梗塞区周边Bax表达,皮层梗塞区周边Bax表达情况（3d）。图示可见在梗塞灶皮层周围有大量Bax阳性表达细胞，20倍镜下计数Bax阳性细胞率，ABC与对照F组比较Bax阳性细胞率显著减低，DE组与F组比较未见差异（* vs. F组 p0.05）,皮层梗塞区周边Bcl-2表达,皮层梗塞区周边Bcl-2表达情况（3d）。图示可见在梗塞灶皮层周围有大量Bcl-2阳性表达细胞，20倍镜下计数Bax阳性细胞率，AB组与对照F组比较Bcl-2阳性细胞率显著增高，CDE组与F组比较未见差异,皮层梗塞区周边Syp表达,皮层梗塞区周边Syp表达,皮层梗塞区周边Syp表达情况。图示可见Syn主要在神经毡内表达，高倍（40）视野下见围绕神经元胞体外侧环状颗粒状阳性表达（箭头所示），在梗塞灶周边表达增强，ABCD组与对照F组比较有显著差异（* vs. F组 p0.05）,皮层梗塞区周边PSD-95表达,皮层梗塞区周边PSD-95表达,皮层梗塞区周边PSD-95表达情况。图示可见PSD-95主要在神经元胞浆表达，高倍（40）视野下见围绕神经元胞体内侧颗粒状阳性表达（箭头所示），在梗塞灶周边残存神经元细胞表达明显，A与对照F组比较有显著差异，其余各组与F组比较未见差异（* vs. F组 p0.05）,Western blot,Western blot法检测梗塞侧大脑半球与神经功能重塑相关的蛋白在不同治疗途径移植骨髓间充质干细胞后表达差异情况。Syp蛋白检测结果显示ABC组与DEF组比较有显著统计学差异，A组与BC组比较有显著差异，BC组之间比较未见显著性差异。 PSD-95蛋白检测结果显示AB组与CDEF组比较有显著统计学差异，A组与B组比较有显著差异，CDEF组之间比较未见显著性差异。,讨 论,1.不同移植途径对骨髓间充质干细胞迁移的影响颈动脉途径移植保证了高细胞浓度，高效率移植 股静脉途径移植需要承受“首过效应” 脑实质移植分布范围局限于注射点周围脑室途径移植细胞则聚集于侧脑室脉络丛组织腰蛛网下腔移植2周后，只在侧脑室内发现少数骨髓间充质干细胞,2.不同移植途径对行为学评价的影响 A组治疗后恢复明显优于其他组，并且在移植后早期治疗效果就可以显现出来A组效果优于C组说明移植骨髓间充质干细胞在脑内的空间分布模式同样影响大鼠脑缺血后神经功能恢复,而C组优于B组，充分说明治疗效果是与达到梗塞灶周围的细胞数量存在量效关系 血管途径移植具有空间分布上的优势，而脑实质注射移植则具备了数量优势。,3.不同移植途径对神经元凋亡的影响A组结果显示动脉移植可以明显的起到抑制凋亡，促进增殖和减小梗塞面积的作用 E组的效果不明显,4.不同移植途径对神经功能重塑的影响各种途径移植骨髓间充质干细胞进入梗塞区后，明显增加了Syp和PSD-95表达 突触功能重塑可能是脑缺血晚期神经功能恢复的原因 突触特异蛋白的表达水平与治疗途径相关,结 论,大鼠多途径移植模型稳定可行细胞移植途径影响