抗菌药物敏感性试验及CLSI

药敏试验及2010年CLSI更新,华中科技大学同济医院 朱旭慧,细菌耐药性变迁G+,金葡菌 MRSA VISA VRSA CA-MRSA青霉素不敏感肺炎链球菌 PISP PRSP耐万古肠球菌 VRE（vanA vanB vanC）,肠杆菌科细菌 大肠、肺克、奇异变形杆菌产ESBLs，AmpC酶等大肠埃希菌耐FQ耐第三代头孢、碳青霉烯类革兰阴性杆菌多重耐药及泛耐药菌不动杆菌属、绿脓、肠杆菌科细菌中的某些种,细菌药敏试验的重要性,细菌耐药性仍呈增加趋势加强对耐药菌的检测、耐药菌带菌者的筛查和耐药机制研究正确合理选用抗菌药和控制耐药菌感染 正确的药敏试验及报告非常重要！,如何进行药物敏感性试验？,纸片扩散法Kirby-baure(K-B)法）稀释法试管稀释法（肉汤稀释法平板稀释法（琼脂稀释法）E-Test,细菌报告应注意的问题,有无细菌：苛养菌、难培养细菌正常菌群/病原菌:病史、病人体征、感染部位药敏结果报告：耐药菌株的提示或修改,完全抑制的抑菌圈直径，包括纸片的直径不反光的黑色背景、反射光下阅读结果抑菌圈的界限应该是以肉眼观察没有明显的可见细菌生长区域在抑菌圈边缘微弱生长的、仅能在放大镜下才能观察到的细小菌落应忽略,正确阅读纸片法结果,正确阅读抑菌圈内的“霾”现象,变形杆菌(迁移生长)以及磺胺类药物的纸片法药敏 注意要读完全抑制的抑菌圈，对“霾”生长不予理会克林霉素对葡萄球菌的抑菌圈内如有薄雾状菌苔应报告细菌对克林霉素耐药,不管其是否显示 “D”抑菌圈需在透射光（Transmitted light）下阅读万古霉素、利奈唑胺和苯唑西林的抑菌圈，遇不敏感的结果需用稀释法测定MIC法确证,E-test试验结果阅读,忽略溶血，读取生长完全被抑制处MIC 0.032ug/ml,杀菌型药物如氨基糖苷类产生“干脆利落”椭圆球 MIC 0.064ug/ml,试条两边产生不同的交界点，读取较高数值侧的MIC。如果两侧差1个稀释度，则须重复试验。 MIC 0.5ug/ml,忽略变形杆菌的迁延现象，MIC 0.064ug/ml,哪些需要做MIC,肺炎链球菌 苯唑西林纸片法直径19mm,需要明确受试菌对青霉素的敏感性，必须做青霉素的E-试验革兰阳性球菌 万古霉素不敏感时（中介或耐药），必须做万古霉素的E-试验确认受试菌对万古霉素的敏感性（包括替考拉宁、利奈唑胺等）草绿色链球菌 对青霉素、氨苄西林 纸片法药敏结果不可靠，必须做上述 两药的E-test,葡萄球菌：某些情况下，对万古霉素纸片法的分辨率低,Clinical Infectious Diseases 2007; 44:153642,万古霉素的MIC方法为常规药敏试验的方法,2009,2008,2009年取消了万古霉素对葡萄球菌纸片法药敏,增加万古霉素剂量不能改善临床疗效,大剂量万古霉素治疗医院获得性MRSA感染， MIC=2g/mL仍导致高治疗失败率,Hidayat LK et al. Arch Int Med. 2006;166:2138-2144.,一项单中心、前瞻性研究，对95例罹患医院MRSA感染的住院或住护理院的老年患者静脉滴注万古霉素，对临床疗效、死亡率、肾毒性进行评价,*到达目标：万古霉素血浆谷浓度达到15-20g/mL；治疗反应：患者发热、白细胞增多症状部分或完全缓解,治疗反应 (%),P=0.02,85%,62%,总体,MIC 1,MIC=2,耐青霉素肺炎链球菌的检测,苯唑西林：1ug/片抑菌圈直径20mm为青霉素敏感株（ MIC0.06ug/ml ）抑菌圈直径19mm可能为青霉素耐药、中敏或敏感株，必须进行青霉素MIC测定。,肺炎链球菌对青霉素药敏试验的判断标准 (mcg/ml),对于三个青霉素的判断标准我们都应该解释和报告吗？,不可能出现的药敏结果,同一株细菌不可能出现的矛盾的药敏结果金葡菌：青霉素S，苯唑西林R；万古霉素R肠球菌：万古霉素S，替考拉宁R肠杆菌科细菌：第三代头孢菌素R，第二、第一代S CLSI附录E（Appendix E)指出的少见或罕见的结果如遇到上述菌株必须重新鉴定细菌和药敏！,2010CLSI主要更新内容,肠杆菌科相关的更新葡萄球菌属相关的更新其他菌种相关的更新表1和表2介绍内容中的更新,2010CLSI主要更新内容,主要格式的更新关于药敏质控的更新（新增Doripenem等质控范围）关于药敏试验操作的更新脆弱拟杆菌的累积药敏报告术语表的更新（新的抗生素亚组-抗MRSA活性的头孢菌素）,肠杆菌科新旧折点(MIC ug/l）,肠杆菌科新旧折点(纸片扩散法，mm),*纸片扩散法折点标准还未建立 CLSI M100CLSI M100-S20. Table 2A.,已评估但未修正的肠杆菌科药敏折点,CLSI M100CLSI M100-S20. Table 2A.,为什么CLSI降低了头孢菌素及氨曲南的折点,以前的折点标准建立于20年前（ESBLs以前）老的和新的-内酰胺酶耐药机制等相关知识的增加 -ESBL问题的复杂化；多种酶导致ESBL检测的准确性降低新的建立折点标准工具的出现 -PK/PD知识的增加,为什么头孢唑啉没有纸片扩散法折点？,修订的MIC折点与相关的抑菌圈直径标准尚未确立需要进一步的研究可能需要使用一种改变含药剂型的新型纸片,ESBLs检测（1）,最初的建议*是基于：-研究观察到某些产ESBLs菌株，药物的MICs有升高但仍然在敏感区（旧折点）-有限的临床观察发现，对于产ESBLs菌株引起的感染，病人预后差。ESBLs试验建议是处理一个新型耐药机制的短期解决方案,ESBLs检测（2）,多重耐药机制的出现可能会使ESBL确证实验受阻 -ESBL+AmpC -ESBL+孔蛋白突变 ESBLs产生于肠杆菌科细菌，而不仅仅是大肠埃希菌、克雷伯菌属和奇异变形杆菌,对于其他的菌株确证实验则存在许多问题与“R”机制相比，MIC与临床预后具有更好的相关性。,CLSI ESBL 检测建议,未被CLSI重新评估的折点头孢孟多头孢尼西头孢哌酮拉氧头孢,在USA这些药物通常是不可行的或为被使用假如使用这些药物的话，我们必须继续在大肠埃希菌、克雷伯菌属和变形杆菌中做ESBL初筛及确证实验-ESBL阳性，将头孢菌素类、青霉素类和氨曲南等药物 “S”修改为“R”,MRS的结果报告原则,MRSA和MRCNS菌株对-内酰胺类药物，如青霉素类、 -内酰胺/ -内酰胺酶抑制剂、头孢类（除外新型的有抗MRSA活性的头孢菌素，如Ceftaroline 、Ceftobiprole ）以及碳青霉烯类体外敏感但临床无效，均需报告为耐药,葡萄球菌属相关的更新,增加的MRSA的定义,“MRSA是指表达mecA基因或其它甲氧西林耐药机制(如青霉素结合蛋白对苯唑西林亲和力改变等）的金黄色葡萄球菌 CLSI M100CLSI M100-S20. pp. 60,MRSA=表达mecA基因 和/或 苯唑西林MIC2 g/ml,金黄色葡萄球菌或路登葡萄球菌检测苯唑西林（OX）和头孢西丁（FOX）,“头孢西丁被作为苯唑西林耐药的替代药物；报告苯唑西林敏感或耐药是基于头孢西丁的结果。假如头孢西丁和苯唑西林都被用于测定金黄色葡萄球菌或路登葡萄球菌，那么两种药物中任一种耐药，该菌株即应被报告为对苯唑西林耐药。” CLSI M100CLSI M100-S20. pp. 62.,金黄色葡萄球菌或路登葡萄球菌检测苯唑西林（OX）和头孢西丁（FOX）,葡萄球菌属:诱导性-内酰胺酶试验,青霉素MIC0.12mg/L抑菌圈直径29mm诱导性-内酰胺酶试验对于严重感染，随后分离出的菌株，实验室应进行青霉素的MIC检测和-内酰胺酶诱导试验,-内酰胺酶的诱导试验,苯唑西林(诱导剂）,菌种划线(BAP、MHA)贴-内酰胺类纸片(OXA、FOX)过夜培养检测抑菌圈边缘的菌落,葡萄球菌属青霉素MIC0.12mg/L抑菌圈直径29mm,葡萄球菌属-D试验,1526mm erm 基因编码的23S rRNA 甲基化报告评论: “由于克林霉素诱导耐药试验阳性,推测此菌株对克林霉素耐药,但在少数患者治疗中克林霉素可能仍有效”。,修订的建议Re：万古霉素MIC,什么时候葡萄球菌应该被送到一个参考实验室做进一步检测？,金黄色葡萄球菌-MIC 4g/mlMaybe-MIC8g/mlYes凝固酶阴性葡萄球菌（CoNS）- MIC32g/mlYes,葡萄球菌属利奈唑胺增加的“R”折点,对利奈唑胺不敏感的的金葡较少，占0.05%（7/15280）。 CLSI agenda book June 2009耐药机制已被识别-rRNA突变和cfe基因介导的耐药（其可被质粒编码） Mendes et al. 2008. Antimicrob Agents Chemother. 52:2244.,-溶血性链球菌组群,青霉素“S”可预报所 列-内酰胺药物的 结果适用于 - 溶血链球菌（大菌落）CLSI M100CLSI M100-S20. pp. 93.,删除的链球菌属草绿色链球菌青霉素结果的外推,“（5）对青霉素敏感的链球菌可认为其对氨苄西林，阿莫西林，氨苄西林，阿莫西林，阿莫西林-克拉维酸，阿莫西林-舒巴坦，头孢克罗，头孢唑林，头孢地尼，头孢吡肟，头孢丙烯，头孢噻肟，头孢布烯（仅A群），头孢曲松，头孢呋辛，头孢泊肟，头孢拉定，头孢唑肟，头孢噻吩，头孢匹林，亚胺培南，厄他培南，氯碳头孢和美罗培南敏感，不需要测定这些药物” CLSI M100CLSI M100-S19S19. pp. 81.,删除,为什么注释re被删除：从草绿色链球菌的青霉素结果外推其他的-内酰胺类药物结果,尽管罕见，但已证实青霉素和头孢菌素类药物之间缺乏交叉敏感性。近来的交叉敏感性数据不多。许多草绿色链球菌对-内酰胺类药物不敏感。大多数草绿色链球菌AST检测来自于严重的感染，需要测定MIC值，