实时荧光PCR

PCR _UU、NG、CT测定,LOREM IPSUM DOLOR,PCR技术基本原理,一、定义PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。,二、PCR反应的基本过程,变性（denaturation） 将模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA经加热至94左右一定时间后，双链之间的氢键断裂，双股螺旋解链，变成两条单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。,二、PCR反应的基本过程,退火(annealing) 模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；,二、PCR反应的基本过程,延伸（extension） DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按A-T、C-G碱基配对与半保留复制原则，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。重复变性-退火-延伸的循环过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。,PCR反应体系的基本成分,模板DNA特异性引物DNA聚合酶dNTP Mg2+的缓冲液。,PCR的反应动力学,PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用YnX*(1E)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，E表示平均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，但随着PCR产物的逐渐积累，其对扩增过程出现负作用，再加上酶的消耗疲劳，整个扩增将进入线性增长期或平台期，此时，扩增产物不再呈指数增加，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期。,实时荧光定量 PCR,原理： 通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图 ( 如图 ) 。,CT 值与起始模板的关系研究表明，每个模板的 CT 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多， CT 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表 Ct 值（如图 所示）。因此，只要获得未知样品的 Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。,TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。,探针荧光技术原理,将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。,实验步骤,解脲支原体DNA测定实验步骤,试剂配制 样本数（样本数待测标本数+质控品5个+1）n配制反应液 UUPCR缓冲液n18ul、Mgcl2n3ul、UU荧光探针n3ul、Tap酶n2ul配制，按26ul分装。,解脲支原体DNA测定实验步骤,标本漂洗液200ul13000rpm离心10分钟吸弃上清加入50ulDNA裂解液震荡混匀、温浴10分钟13000rpm离心2分钟上样低速离心数秒全自动荧光PCR仪扩增程序：50-1分钟 94-2分钟 945秒6030秒（循环40次）,实验结果,结果解读,一.PCR出现假阴性原因： 1模板因素： （1）模板中含有杂蛋白； （2）模板中含有Taq酶抑制剂； （3）模板中蛋白质残留，特别是染色体中的组蛋 白残留； （4）提取制备模板时丢失过多； （5）模板核酸变性不彻底。解决：1.配制有效而稳定的消化处理液; 2.提取程序固定,不宜随意改动；3.模 板DNA的溶解液应固定不变。,2酶失活1.）酶本身的质量问题(供应商的问题）；2.）酶存放时间太长；3.）酶存放方式不当，或其他意外原因；4.）忘记添加Taq酶。,3、引物：质量；浓度；两条引物的浓度是否对称等。解决：1.选定一个好的引物合成单位; 2.引物浓度不仅要看OD值，稀释时更要平衡其摩尔浓度； 3.引物应高浓度小量分装保存，防止反复冻融或长期冷冻保存，导致引物的变质降解失效，也可要求合成单位将固体分装； 4.引物设计不合理，如长度不够，引物本身或两条引物之间形成二聚体等。,4、 Mg2+浓度： Mg2+浓度对PCR扩增效率影响极大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性；浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败，出现假阴性。5、 物理原因：1.变性温度低，变性时间短；2.退火温度过高，影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率；3.延伸时间过短等。,二.PCR出现假阳性原因：1.引物设计不合适。 1）.选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，从而扩增出非目的性序列的PCR产物。 2）.靶序列太短或引物太短导致特异性不强。解决： 选择特异性强的区段设计引物。,2.靶序列或扩增产物的交叉污染。解决方法：1.操作时小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管污染 环境。 2.除酶及不耐热物品外，所有试剂及耗材均应高温高压消毒，所用离 心管及枪头均应一次性使用。 3.必要时，加样本前，反应管及试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。,三.出现非特异扩增带原因：1.引物与靶序列不完全互补，或引物聚合形成二聚体；2.Mg2+浓度过高，退火温度过低，PCR循环次数过多；3.酶的质量不过关，或加Taq酶的量过多。解决方法： 1.必要时重新设计合成引物； 2.减低酶量或调换另一来源的酶； 3.降低引物量，适当增加模板量，减小循环次数； 4.适当提高退火温度或采用二温度点法（94 变性，65 左右退火与延伸）,临床意义为临床的诊断与治疗提供实验室依据,解脲支原体DNA定性 解脲支原体在非淋球菌性尿道炎中，有50%是由本病引起的。如果孕妇生殖道带有解脲支原体，可通过胎盘感染胎儿引起早产、死胎，分娩时可引起新生儿呼吸道感染。另外还可导致不孕不育。因此，妇产科普查解脲支原体有很重要的意义。 淋球菌DNA定性 男性可发生尿道炎。女性可引起尿道炎及子宫颈炎。不经治疗或治疗不彻底，可致慢性感染。胎儿经产道时，可感染淋病性急性结膜炎。