真菌实验报告

1 / 13 真菌实验报告 真菌学实验报告 一 .实验目的： 了解真菌形态的基本特征。 掌握丝状真菌制片方法。 掌握内生真菌的分离方法 掌握真菌的鉴定方法。 二 .前言： 真菌广泛分布于地球表面 ,从高山、湖泊到田野、森林，从海洋、高空到赤道、两极，到处都有真菌。真菌虽然不在空气中生长繁殖 ，但它的孢子却成群的漂浮在天空，只要稍微注意你会发现人类原来生活在真菌的汪洋大海中。 当今世界，生物技术已迈入世界经济的支柱产业，真菌学在生物技术的大潮中得到了长足的发展。真菌是原始的真核生物，具有广泛的多样性，真菌生长我繁殖迅速，在很短的时间内就可以得到比动物和植物多得多的后代，能够直接、快速地进行遗传性状分离的 分析。因此，真菌可以作为研究基础生物学过程中的一个重要工具，真菌基因的多样性以及真菌分子生物学的发展，为生物技术产业提供了一个广阔的天地。 植物的生长环境直接影响内生真菌的生物多样性，2 / 13 植物物种的年代越久远，其生物内生真菌的多样性越丰富：抗病原性能越强的植物，其所含的内生真菌具有抗菌活性的可能行就越大； 其所含的内生真菌有可能产生与植物相同或相似的抗菌无知或产生抗菌活性物质可能参与了药用植物的抗菌过程，本实验通过植物病原真菌和 G+、 G-细菌的抑制实验发现茎，根，花，种子或果实内生真菌的代谢产物具有不同程度的抑菌能力，并且对 G+、 G-有普片遍的抑菌作用。研究和开发内生真菌的寻找新的抗菌活性物质具有广泛的应用前景。 三 .材料与方法： 材料： 在校园内采集银杏、喜树、桂花树样品包括叶、茎、 根、花、种子或果实。 药品与试剂： 葡萄糖、蛋白胨 、 KH2P04 3H2O、 MgSO4 7H2O，马铃 薯、琼脂。孟加拉红，青霉素，链霉素，甲基蓝，蛋白胨，酵母膏，蔗糖，磷酸盐，葡萄糖，琼脂条，无菌水等。消毒剂： 75%的乙醇， %升汞，次氯酸钠溶液， 30%双氧水。双 蒸水、琼脂糖， Tris 饱和酚、巯基乙醇，石英砂， Tris饱和酚，氯仿，异戊醇，无水乙醇，硼酸，冰醋酸，氯化钠，3 / 13 盐酸，氢氧化钠， EDTA， CTAB。 培养基： 马铃薯、葡萄糖琼脂培养基 马铃薯汁 1000ml，葡萄糖 20g，琼脂 20g 分中号试管包扎，高压 115 20 分钟。趁热斜好，凝固备用。 马丁氏培养基 葡萄糖 10g，蛋白胨 5g， KH2PO4 1g， MgSO4?7H2O ，1% 孟加拉红，琼脂 20g， 水 1000mL， pH 值自然。 抗生素用法与用量：培养基灭菌之后分装前按链霉素 40U/mL，青霉素 30U/mL 用量加入，冷却到 45左右未凝固时加入抗生素，混匀倒平板。 四 .方法： 采样方法： 在校园内找到银杏、喜树、桂花树并 用刀采集叶、茎、 根、皮、种子。 样品前处理： 分别取根、茎、叶、果实，用洗涤剂在自来水下洗净。 4 / 13 老树皮用 75%酒精进行表面消毒后，用镊子取出，于 酒精灯上烧灼 15 秒至表面焦糊，切成 1 1cm2 大小置于 PDA 固体培养基上。 对于根、茎、叶、果实按下列程序进行表面消毒： 75%的酒精漂洗 2-3min无菌水冲洗 4-6 次 %升汞不同的消毒时间无菌水冲洗 4-6 次用灭菌滤纸吸干多余水分无菌刀片将材料切成小块将根、茎的表皮、韧皮 部、木质部大致分开，并切成大小。 将果实的外种皮去掉，消毒之后将内种皮去掉。 灭菌时，沥干的植物材料转放到烧杯中，记好时间， 倒入消毒溶液，不时用玻璃棒轻轻搅动，以促进材料各部分与消毒溶 液充分接触，驱除气泡，使消毒彻底。在快到时间之前 1-2 分钟，开始把消毒液倾入一备好的大烧杯内，要注意勿使材料倒出，倾净后立即倒入无菌水，轻搅漂洗。灭菌时间是从倒入消毒液开始，至倒入无菌水时为止。灭菌液要充分浸没材料。宁可多用些灭菌液，切勿勉强在一个体积偏小的容器中使用很多材料 灭菌。 内生菌的分离方法： 将上述组织块置于分离培养基上于 27恒温培养，同时将上述消毒过程中最后一次冲洗组织块后的无菌水滴在培养基上平行培养，用以检测消毒是否彻底。观察菌丝生5 / 13 长情况及污染情况。 纯化方法： 培养 3-4 天后及时采用尖端菌丝挑取法，挑取形 态不同的菌丝或菌落移种到新鲜 PDA 培养基上。纯化 3-4 次以保证所得菌落为纯培养。 形态鉴定方法： 培养方法： 培养基：查氏培养基、沙氏培养基和 PDA 培养基。 将 4保存菌种活化 2 次； 将活化菌种分别点种 PDA、沙氏、察氏平板，每重复 恒温培养箱培养 7 天； 然后进行菌落特征描述，取一个平行进行制片，观察个体形态； 另两个平行继续培养至 14 天，取出； 实验报告 10 生物技术班 夏志强 10521012 实验一 平菇栽培实验 一实验目的与原理 1目的：通过实验，使同学们掌握平菇塑料袋栽培技术。 2原理：选择适宜的培养料配方，准确称取培养料厚加水搅拌均匀，层播 6 / 13 法装袋接种，在适宜条件下培养菌袋。待菌丝长满培养料后，给予适宜的温、光、湿、气等条件，进行出菇管理。 二实验用品 材料：棉籽壳，水，石膏 器材：锅，塑料袋，酒精灯，镊子，剪刀 三实验内容 1.培养料配制：按照需要量准确称取棉籽壳， 倒在地面，将石灰加入水中搅拌均匀，然后倒入棉籽壳中翻拌均匀。注意含水量要适宜。含水量判断方法为用手握少量培养料用力握有水渗出而不下滴为宜。 2.装袋接种：采用层播法装 袋播种。先撒上一层菌种，装入培养料，待装料至料袋的四分之一时，撒上一层菌种，待装料至料袋的一半时，撒上一层菌种，封口。 4.菌袋培养：袋装好后搬回宿舍进行培养观察，控制温度 25左右、空气相对湿度 70以下，保持空气新鲜，暗光培养。 30 天左右菌丝可以发满菌袋。 6.采收和后茬管理 待平菇菌盖平展、连柄处下凹、边缘平伸时，就可以采收。采收后清理料面，停水养菌 5 天左右，再进行后茬菇的管理。 7 / 13 四注意事项 所压的料应内松外紧，便于菌生长 ，防止水分过度蒸发，并且上下松紧一致决不允许培养料中出现分层或有大量缝隙；每袋装料不超过 2/3 袋长。建议每袋料装 35 cm压一次料，每次压到边缘时，手扶袋，一手用大拇指侧向内压，切记不宜压得太紧，用手握装好的料有松散感，但不散开为宜。 接种：将装好的料用筷子打一个孔直到底部，在底部上一点也可以，然后将菌种均匀的洒在培养料 上，接种量不可过多，只要大致覆盖住培养料即可做个标记。 五实验结果 本课程，本课程是大学本科生物技术、生物科学专业的选修课程。介绍真菌分类现状、分类方法、分类依据及其原则。本课程的教学不限于介绍研究的成果，重在介绍分析和解决问题的方法，以培养学生分析问题和创新的能力。所以在理论学习的同时开设综合性实验，培养学生观察、分析和动手能力。基本掌握真菌分离、鉴定的方法，并应用于真菌其它领域的研究。 本指导书适用于生物技术和生物科学专业。 1、实验：内生真菌的分离及鉴定 ?8 / 13 ?3 2、实验报告基本内容要求 ?7 3 、 实 验 报 告 格式 ?8 实验 内生真菌的分离及鉴定 实验学时： 18 实验类型：综合 实验要求：选修 一、实验目的 1.了解真菌形态的基本特征。 2.掌握丝状真菌制片方法和真菌鉴定方法。 二、实验内容 采集植物样品包括叶、茎、根、花、种子或果实，然后对分离样品的内生真菌，并进行形态和分子生物学方法的鉴定。 三、实验原理、方法和手段 实验原理 根据真菌的形态特征和 ITS 序列等分子证据对分离到真菌 进行归类和鉴定。 9 / 13 实验手段和方法 1、内生真菌分离纯化方法 样品的表面消毒及预处理 分别取根、茎、叶、果实，用洗涤剂在自来水下洗净。 老树皮用 75%酒精进行表面消毒后，用镊子取出，于酒精灯上烧灼 15 秒至表面焦糊，切成 1 1cm2 大小置于 PDA固体培养基上。 对于根、茎、叶、果实按下列程序进行表面消毒： 75%的酒精漂洗 2-3min无菌水冲洗 4-6 次 %升汞不同的消毒时间无菌水冲洗 4-6 次用灭菌滤纸吸干多余水分无菌刀片 将材料切成小块 将根、茎的表皮、韧皮部、木质部大致分开，并切成大小。 将果实的外种皮去掉，消毒之后将内种皮去掉。 灭菌时，沥干的植物材料转放到烧杯中，记好时间，倒入消毒溶液，不时用玻璃棒轻轻搅动，以促进材料各部分与消毒溶液充分接触，驱除气泡，使消毒彻 底。在快到时间之前 1-2 分钟，开始把消毒液倾入一备好的大烧杯内，要注意勿使材料倒出，倾净后立即倒入无菌水，轻搅漂洗。灭菌时间是从倒入消毒液开始，至倒入无菌水时为止。灭菌液要充分浸没材料。宁可多用些灭菌液，切勿勉强在一个体积偏 小的容器中使用很多材料灭菌。 10 / 13 内生真菌的分离与纯化 将上述组织块置于分离培养基上于 27恒温培养，同时将上述消毒过程中最后一次冲洗组织块后的无菌水滴在培养基上平行培养，用以检测消毒是否彻底。观察菌丝生长情况及污染情况。培养 3-4 天后及时采用尖端菌丝挑取法，挑取形态不同的菌丝或菌落移种到新鲜 PDA 培养基上。纯化3-4 次以保证所得菌落为纯培养。 2、真菌的形态学鉴定方法 对分离到的内生真菌的分类鉴定主要根据宏观的培养性状，微观的个体形态特征及一些生物学特性进行经典 分类研究。 培养性状 培养基：查氏培养基、沙氏培养基和 PDA 培养基。 方法：将固体培养基制成平板，以点植法接钟，即用接种针尖沾取少量孢子点植在平板的中心位置，然后于25-28培养一定时间进行观察，观察时可用肉眼或借助放大镜等。 观察的要点： 大小：以菌落的直径表示。 颜色：包括菌落表面和背面的颜色，及色素是否渗入培养基。 菌落表面的纹饰：如皱纹、辐射沟纹、同心环、整11 / 13 个菌落致密或疏松等。 菌落的质地：毡状、毯状、绒毛状、棉 絮状、粉粒状、革质状、有无成束状或绳状的气生菌丝。 菌落的高度：扁平、凸起或隆起，及菌落中心部分状况等。 菌落边缘：全缘、锯齿状、树枝状等。 渗出物：菌落表面有无液滴及液滴的颜色等。 个体形态 菌丝的特征：表面性状，宽度等 分生孢子梗：分支情况 -简单或复杂，轮生或单生等；长短；基部粗糙或光 滑等。 产孢结构的形态特征：形状，大小，着生状况 分生孢子的形态：形状，大小，表面状况，聚集方式 真 菌制片方法 粘片法 胶带粘贴法：选用在显微镜油镜下观察细致不粗糙且粘性好的胶带。取一小段胶带从菌落表面的中心向边缘粘， 75%乙醇固定，乳酸石炭酸棉蓝染色液染色，将粘有菌丝的一面向上，盖上盖玻片，于显微镜下观察产孢结构等特征。 显微摄影照片 在 Motic 数码显微镜下，观察并选取具典型性状特12 / 13 征的视野拍照、直接测量相关数据和进行描述记载。 菌种的鉴定 根据描述的菌种的特征，索引分析相关文献，综合分析对比相关特征的异同，最后确定待定菌株的分类地位。 3、真菌的分子生物学鉴定方法 真菌菌丝的获得 固体培养基培养菌丝体 对于气生菌丝较多的真菌可以选择 PDA 固体培养基在培养皿上培养，在固体培养基平板上铺一层玻璃纸， 27培养 5-7 天。将 3-4 个用培养皿平行培养的新鲜菌丝小心地刮下，收集在一起，以备进行 DNA 提取。在刮取菌丝体时，要注意的是不要把培养基一起刮下来，以免对提取