线粒体疾病的分子生物学检验.ppt

线粒体疾病的分子生物学检验Moleculardiagnosisformitochondrialrelateddisorders 2 线粒体 Mitochondrion 1 真核细胞中的细胞器 二分裂方式进行新陈代谢 平均寿命10天2 多数细胞含几个到几千个线粒体3 每个线粒体含2 10线粒体DNA mtDNA 3 线粒体功能 MitochondrialDisease Chest2001 120 634 648 ATP 能量代谢 其他功能 储存钙离子调节膜电位并控制细胞程序性死亡细胞增殖与细胞代谢的调控合成胆固醇及某些血红素产热 Wikipedia 线粒体病Mitochondrialdisorders 发现 1962年 Lufe等发现一位年轻的瑞典妇女伴有异常增高的基础代谢率 同时伴有线粒体结构的异常和氧化磷酸化功能的异常 直到1988年 Wallace等报道了首例由线粒体DNA突变引起的人类疾病 明确了mtDNA突变可引起人类疾病 定义 是遗传缺陷引起线粒体异常 致使ATP合成障碍 能量来源不足等导致的一组异质性病变 又称为线粒体细胞病 发病率 约为1 5000 约每5000人中1人发病 Smeitink2006 线粒体病mitochondrialdisorders 是一组高度临床变异性和遗传异质性的疾病 线粒体蛋白 16 569bpcirculardoublestranded mtDNA 20 1 500nucleargenes80 structuralproteinoftheOXPHOScomplexesproteinrequiredforassemblyofOXPHOScomplexesproteinsinvolvedinmtDNAtranslationproteinsinvolvedinmtDNAmaintenanceproteinsinvolvedinmitochondrialfusionandfission DouglasC Wallace 1817 1819 Shoubridge 2001 Schapira 2000 进一步导致线粒体功能异常 底物的运输缺陷 底物的利用缺陷 柠檬酸循环异常 氧化磷酸化脱偶联 呼吸链异常 发病特点 核基因突变 常染色体隐性 显性遗传或X 连锁遗传 线粒体基因突变 母系遗传 突变的mtDNA在母血增加 受累及的后代发病频率增加 mtDNA突变与临床表型之间关系复杂 主要表现为同一种mtDNA突变可以引发多种不同的疾病表型 而同一种疾病表型又可以由多种不同的mtDNA突变诱导 遗传异质性 婴幼儿起病较常见 编码线粒体结构蛋白的核基因突变进行性外眼肌麻痹 PEO 线粒体神经肠胃脑肌病 Leigh氏综合征线粒体蛋白质翻译相关的核基因突变2004年Miller等首次报道核基因编码的线粒体核糖体蛋白亚单位16 MRPS16 纯合突变 导致先天畸形伴张力衰竭 四肢水肿 肝转氨酶活性升高并乳酸亚基中毒症 该女婴在出生后3天死亡 核基因突变 线粒体基因突变 突变的影响 引起呼吸链功能缺陷氧化磷酸化酶异常阈值效应 组织特异性突变的mtDNA在复制分离时可能不均等分配母系遗传 不同突变后代发病风险不同 相比A8344G突变 携带A3243G突变的母系后代更容易发病 突变分布 同质性 各器官组织分布相同异质性 不同组织 细胞分布不同 一般特点 母系遗传 MaternalInheritance 11 同质性突变与异质性突变 12 线粒体基因同质性 Homoplasmy 0或100 异质性 Heteroplasmy 0 100 核基因纯合子 Homozygous 0或100 杂合子 Heterozygous 50 mtDNA同质性 异质性突变与阈值 13 线粒体基因突变 点突变目前已报道的mtDNA点突变将近330种 涉及mtDNA编码的各个基因 其中结构基因突变177种 tRNA基因突变137种 rRNA基因突变12种 D Loop区突变2种LHON 线粒体脑肌病合并乳酸血征及卒中发作综合征 肌阵挛癫痫 破碎红纤维病 母系遗传糖尿病伴耳聋综合征等重排重排突变逾数百遗传性痉挛性截瘫等 http 线粒体疾病是复杂性疾病 遗传方式复杂常染色体隐性遗传 AutosomalRecessive 常染色体显性遗传 AutosomalDominant 性连锁遗传 Sexlinked 母系遗传 Maternallyinherited 临床表型复杂累及多系统 Multisystemicinvolvement 影响几乎所有组织器官 Anyorganortissuecanbeaffected 15 16 线粒体功能涉及众多的组织器官 线粒体病的共同临床特点 婴儿期发病 常见于婴儿伴随COX阴性肌纤维 脑病和Leigh综合征 儿童发病 见于MELAS MERRF Leigh病 线粒体肌病 线粒体心肌病和KSS 中枢神经系统损害 共济失调 癫痫 肌张力下降 脊髓病等周围神经损害 交感神经病出现在MNGIE和Wolfram综合征视听神经损害 视神经病出现在Leber病和显性遗传视神经萎缩1型听力丧失出现在KSS肌肉病见于线粒体肌病 MELAS和KSS 眼外肌麻痹见于KSS和PEO 高度临床变异性 Chinneryetal Lancet2000 线粒体疾病的生化诊断 当患者基因变异不能被确定时 完整的生化检查可以辅助诊断 代谢产物分析 血液 尿液 脑脊液等 血液可以正常 但脑脊液多异常 动脉比静脉好 乳酸 丙酮酸比高 50 1 提示呼吸链受到阻断 正常不除外线粒体疾病 酶测定氧化磷酸化 OXPHOS 系统的酶活性测定 western 比色法等 方法不稳定一般情况下 血清CK 肌酸激酶 正常或轻度升高 升高占30 见于慢性进行性眼外肌麻痹 mtDNA丢失时非常高 JinheritMetabDis 2011April 34 2 283 292 19 线粒体疾病的生化诊断 当患者基因变异不能被确定时 完整的生化检查可以辅助诊断 肌肉活检线粒体病的肌肉病理改变特点 1 出现线粒体结构异常 细胞色素阴性肌纤维或破碎红纤维 RRF 为主要病理改变 2 上述病理改变出现的频率高 3 缺乏其他的肌肉病理改变 JinheritMetabDis 2011April 34 2 283 292 儿童及成人线粒体疾病的诊断标准 A符合线粒体脑肌病各综合征的临床表现如KSS CPEO MELAS MERRF等 多系统不明原因发病必须至少三个系统出现临床症状除先证者外 至少有一个母系家族成员有发病可能排除其它代谢和非代谢疾病B肌活检在骨骼肌中存在 2 破碎样红肌纤维 主要诊断标准 Bernieretal 2002 3 5 21 C有以下一种或多种呼吸链酶活性受抑制的表现 50岁以下肌活检COX阴性肌纤维 2 50岁以上肌活检COX阴性肌纤维 5 任一组织中呼吸链酶活性 20 任一细胞系中呼吸链酶活性 30 多于两组织内相同呼吸链酶活性 30 主要诊断标准 次要诊断标准 A症状符合线粒体脑肌病的临床表现 至少以下一种提示肌肉中线粒体异常的表现 30 50岁肌活检RRF在1 2 30岁以下肌活检出现RRF 电镜下见广泛线粒体异常 B至少一种呼吸链功能受抑制的表现 生化或极谱描记的呼吸链复合物活性在20 30 用免疫方法证实呼吸链复合物表达减少 Bernieretal 2002 3 5 次要诊断标准 C发现可能相关的mtDNA异常 D一种或多种氧化磷酸化受损的表现 脑脊液或血中乳酸 丙酮酸和 或 丙氨酸增高 若疑为KSS 脑脊液蛋白质增高 PET或31P MRS证实肌肉或脑代谢降低 最大氧分压 平均氧分压或乳酸阈值降低 Bernieretal 2002 3 5 符合以上2个主要诊断指标或1个主要诊断指标及2个次要诊断指标的即为确诊线粒体病 符合1个主要诊断指标及1个次要诊断指标或至少3个次要诊断指标的为拟诊线粒体病 符合1个主要诊断指标或在符合临床表现的基础上还具备1个次要诊断指标的为疑诊线粒体病 JinheritMetabDis 2011April 34 2 283 292 线粒体病诊断时应注意 基因诊断与生化检查如能量代谢情况 呼吸链和酶复合体活性等相结合要区分病理性突变和正常衰老所致的线粒体基因突变线粒体基因异常与临床表现的严重程度之间存在量效关系散发与遗传的相关性 诊断是否遗传需排除环境 药物和衰老等因素 26 第一节线粒体基因组与疾病 线粒体基因组及其表达系统线粒体基因组与细胞核基因组的相互关系线粒体基因组变异与疾病 27 人类线粒体基因组 Lightstrand 8tRNAand1mRNA ND6 Heavystrand 14tRNA 2rRNA and12mRNAPolycistronicwithposttranscriptionalprocessing 基因组小 仅16569bp双链环状DNA13结构基因 mRNA22tRNA基因2rRNA基因12SrRNA基因16SrRNA基因非编码区D loop 约1120bp L链复制起始区 约30 50bp tRNAAsn tRNACys 高突变率 线粒体基因组及其表达系统 ThetwostrandsofmtDNAaredifferentiatedbytheirnucleotidecontentwiththeguaninerichstrandreferredtoastheheavystrand andthecytosinerichstrandreferredtoasthelightstrand Theheavystrandencodes28genes andthelightstrandencodes9genesforatotalof37genes Ofthe37genes 13areforproteins polypeptides 22arefortransferRNA tRNA andtwoareforthesmallandlargesubunitsofribosomalRNA rRNA Transportchain 13peptides Manyofthegenesencodethetransportchain 2rRNAsMitochondrialrRNAisencodedbyMT RNR1 12SrRNA MT RNR2 16SrRNA 22tRNAsThefollowinggenesencodetRNA ControlregionD loop 576 Replication HumanmitochondrialDNA mtDNA hasthreepromoters H1 H2 andL heavystrand1 heavystrand2 andlightstrandpromoters TheH1promotertranscribestheentireheavystrandandTheLpromotertranscribestheentirelightstrand TheH2promotercausesthetranscriptionofthetwomitochondrialrRNAmolecules Transcription Theprocessoftranscriptioninitiationinmitochondriainvolvesthreetypesofproteins themitochondrialRNApolymerase POLRMT 2 mitochondrialtranscriptionfactorA TFAM 3 mitochondrialtranscriptionfactorsB1andB2 TFB1M TFB2M 43 第一节线粒体基因组与疾病 线粒体基因组及其表达系统线粒体基因组与细胞核基因组的相互关系线粒体基因组变异与疾病 44 核基因组与线粒体基因组的相互作用 核基因组编码了1500多个线粒体蛋白 线粒体基因组只编码了13条多肽链 交叉对话 cross talk 机制 45 第一节线粒体基因组与疾病 线粒体基因组及其表达系统线粒体基因组与细胞核基因组的相互关系线粒体基因组变异与疾病线粒体基因组变异碱基突变 点突变 其中结构基因的点突变 与核基因组一样 包括同义突变和错义突变缺失与插入 mtDNA拷贝数目突变 线粒体基因组变异与疾病耳聋 Leber遗传性视神经病变 糖尿病 高血压 肿瘤 46 在线粒体相关疾病中常见的DNA点突变 MELAS综合征 线粒体脑肌病乳酸酸中毒及卒中样发作 A3243G 80 T3271C 在tRNALeu UUR 基因 MERRF 肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维 A8344G 80 T8356C 在tRNALys基因 Leber视神经病 LHON G11778A 在ND4基因 G3460A 在ND1基因 耳聋 Deafness A1555G T1494C 在12SrRNA基因 A3243G 在tRNALeu UUR 基因 2型糖尿病 Type2Diabetes A3243G 在tRNALeu UUR 基因 NARP 共济失调伴色素性视网膜炎神经病 T8993G T8993C 在ATPase6基因 线粒体病的分子诊断 标本选择 外周血白细胞 最常用毛发唾液尿液骨骼肌 检测mtDNA分子诊断的最好标本 检测已知DNA突变的方法 等位基因特异性寡核苷酸杂交 ASO 等位基因特异性扩增 ASA 限制性片段长度多态性分析 PCR RLFP 连接酶链反应 LCR 基因芯片技术 检测未知DNA突变的方法 单链构象多态性 PCR SSCP 变性梯度凝胶电泳 DEEG 异源双链分析 HA DNA序列测序变性高效液相色谱 DHPLC 分子诊断方法 49 线粒体疾病中常见的突变 核基因突变 nucleargenemutations 氧化磷酸化系统由核基因编码的蛋白质 例如 Surf1 SCO2 NDUFV1 NDUFS1 etc 呼吸链缺陷 重复 缺失线粒体DNA点突变 mtDNApointmutations LHON MELAS MERRF NARP etc mtDNA缺失 重复 mtDNADeletions duplications eg KSS Pearsonsynd diabetes deafness未知遗传 unknowninheritance 50 第二节线粒体基因组与耳聋 与耳聋相关的mtDNA突变耳聋相关的mtDNA突变的检测 千手观音 21位聋哑演员中18人有药物史部分患者使用正常剂量也会致聋 一针致聋 现象 53 第二节线粒体基因组与耳聋 与耳聋相关的mtDNA突变耳聋相关的mtDNA突变的检测PCR RFLP技术DHPLC技术DNA测序技术基因芯片技术 54 对1642例氨基糖苷类诱发的非功能性耳聋汉族聋儿进行线粒体12SrRNA变异检测 J Luetal Mitochondrion 2010 10 4 380 390 55 56 12SrRNA基因中有68个核苷酸变异所有的核苷酸变异均为同质性68个核苷酸变异中 有3个C1494T其余65个变异为A1555G 57 58 59 第三节线粒体与Leber遗传性视神经病变 与Leber遗传性视神经病变相关的mtDNA突变Leber遗传性视神经病变相关的mtDNA突变常用检测技术 Leber sHereditaryOpticNeuropathy LHON Leber sHereditary inheritedfrommitochondrialDNAOptic affectstheeyeNeuropathy disease abnormalityofnervoussystem DegenerationofretinalganglioncellsandtheiraxonsInheritedfrommaternalmitochondrialDNAOccursduringyoungadulthood AcutePhase Painless acuteonsetofcentralvisionlossLossofvisualacuity colouroncesymptomsappearinoneeye othereyeaffectedweekslater SubacutePhaseatrophyofopticdisclegallyblind Asymptomaticuntilvisualblurringdevelops SignsandSymptoms MaternalinheritanceMutationoccursinmitochondrialDNA mtDNA OnlytheeggcontributesmtDNAtotheembryo GeneticsofLHON 1 G11778A 50 60 LHONpopulation 2 G3460A 8 25 LHONpopulation 3 T14484C 10 LHONpopulation SinglePointMutations3majorpathogenicmutations G14459AT14484C Malesvs Females LHONispredominantinmalesStudieslookingatx linkagehavenotbeenconfirmednorstatisticallysignificant Epidemiology racedependent 11778 3460 14484 70 Europeans90 Asians 86 QuebecCanadiansDuetoFounderEffect 奠基者效应 Koreans presenceofmixtureofmorethanonetypeoforganellargenomeiemtDNANumerouscelldivisionsandthuslotsoftimeisrequiredformutantallelestobeexpressedinmitochondriaSymptomsdon tappearuntiladulthoodAlsoimplicatedasthereasonforvariabilityinseverityofvisionloss Heteroplasmy PhotoreceptorsInterneuronsRGC retinalganglialcells NeuronsAxonsmakeupopticnerve Retina FireactionpotentialsHugeATPdemandVerysensitivetoenergysupplyandmitochondriadefectsEspeciallyRGCsforcentralvisualfieldLimitedregenerationabilities RGC neurons Otherneuronsinthebodycanbeaffectedtoo CNS PNS ThisresultsinLeber sPlusMovementdisordersTremorsCardiacconductiondefectsMS like 多发性硬化样 features AllNeuronsareVulnerable ATPDemand Complex1 e prematurelyleaktoO2 aka NADHDehydrogenase 4e 4H O2 2H2O e O2 O2 Leber oxidativestress ATPdeprivationAtrophy wearingawayoftissueChronicoxidativestress Apoptosis celldeath Thingsgowrong Thelinkisimportant GeneticTestingforthematernallyinheritedmitochondrialDNA Avoidpotentialenvironmentalprecipitantssuchastobaccoandexcessivealcohol Avoidmedicationswhichhavebeenshowntoinducethedisease Ethambutol乙胺丁醇 Chloramphenicol氯霉素 VisiondamagefromdegenerationofopticnerveMaternallyinheritedthroughmtDNA3pointmutationsComplexI ROS reactiveoxygenspecies TreatmentAntioxidantsInhibitmitochondrial dependentapoptosis 79 原发性突变 G3460A G11778A T14484C的突变 占全部LHON的80 90 继发性突变 T3394C T4216C C4019T G5244A C4777T G9438A G13708A G15257A新突变 A4435G位于tRNAMet基因可以调节ND4G11778A突变的外显率 与Leber遗传性视神经病变相关的mtDNA突变 80 A4435G可以调节ND4G11778A突变的外显率 tRNAMet 81 第三节线粒体与Leber遗传性视神经病变 与Leber遗传性视神经病变相关的mtDNA突变Leber病变相关的mtDNA突变常用检测技术PCR RFLP技术PCR SSCP技术DHPLC技术DNA测序技术 G3460A G11778A T11484C原发性突变测序图 82 第四节线粒体与糖尿病 线粒体糖尿病美国糖尿病协会 1997 世界卫生组织 1999 制定了新的糖尿病分型标准 将线粒体基因缺陷型糖尿病列为特殊类型糖尿病 属于 细胞功能遗传缺陷型糖尿病 约占糖尿病总数的1 3 据浙江省糖尿病防治中心提供的数据 浙江省糖尿病患病率为2 96 线粒体DNA突变与糖尿病线粒体糖尿病的检验诊断 83 第四节线粒体与糖尿病 线粒体糖尿病线粒体DNA突变与糖尿病线粒体糖尿病的检验诊断 84 线粒体DNA突变与糖尿病 85 携带tRNALeu UUR A3243G突变的糖尿病家系 86 A3243G为异质性突变 RFLP DNASequencing DHPLC Control A3243G A3242G WT 87 携带tRNAGlyT10003C突变的糖尿病家系 88 tRNAGly T10003C为同质性突变 89 A tRNAGly tRNAs tRNAThr tRNAs 90 SecondarystructureoftRNAGly SecondarystructureoftRNALeu UUR 91 92 第四节线粒体与糖尿病 线粒体糖尿病线粒体DNA突变与糖尿病线粒体糖尿病的检验诊断PCR技术正向引物 F 5 TTCACAAAGCGCCTTCCCCC 3 反向引物 R 5 GCGATGGTGAGAGCTAAGGTC 3 扩增片段398bp 3153 3551bp DHPLC技术PCR RFLP技术DNA测序技术 分子诊断研究 A3243G异质性分析 收集病人外周血 抽提DNA PCR扩增目的片段 PCR RFLP 测序验证 RT ARMs qPCR amplificationrefractorymutationsystem Pyrosequencing 焦磷酸测序 TargetedNext GenerationSequencing二代测序 High throughputsequencing 实例 母系遗传糖尿病家系 注 母系成员共24人 其中糖尿病患者为10人 相应PCR产物经普通测序验证 MIDD母系遗传性糖尿病伴耳聋 maternallyinheriteddiabetesanddeafness PCR RFLP 图含mtDNA3243PCR产物的限制性内切酶 ApaI 酶切结果图 mtDNA3243异质性突变检测结果 M DNAmarker Lane1 2 3 6 7 8 9 10 11 12 13 16 17 mtDNA3243异质性突变 Lane4 5 14 15 mtDNA3243未突变 限制酶Apa 的酶切位点 GGGCC C 由于该突变为异质性突变 故应该会出现553 423 130bp共3条条带 而野生型没有Apa 的酶切位点 故电泳只能看到长度为553bp的1条片段 引物 可以覆盖整个线粒体DNA基因组 3组 PCR产物富集过程 基因组DNA文库 高通量捕获测序 TargetedNext Gen