第4章 体内药物分析方法的建立和验证ppt课件.ppt

第四章体内药物分析方法的建立与验证 第一节分析方法的设计依据一 待测药物的理化性质及体内存在状况1 待测药物的理化性质1 待测药物的pKa值及其亲脂性 水和有机溶的分配系数等决定萃取方法2 药物挥发性判定是否GC检测3 药物的紫外 荧光 电化学特性决定检测方法4 药物酸碱 光 热的稳定性2 待测药物的体内状况 1 蛋白结合强时 不宜用溶剂萃取2 原形药物与代谢物共存时 分离度是否良好3 药物浓度过低采用高灵敏度方法2 分析测定的目的与要求1 药代动力学研究A 测定血中的药物和代谢物B 要求较宽的线性范围 Cmax Cmin1 10 1 20 C 较高的灵敏度 10 9g ml 准确度D 分离度大于1 5E 常用的仪器HPLC GC LC MS 2 血药浓度监测A 要求线性在有效浓度范围内B 分析方简便 易行 适用于长期和批量样品测定C 常用的仪器TDX3 生物样品的类型与样品制备方法A 生物样品的类型与样品制备与分析方法与有密切关系B 血浆血清 用蛋白沉淀 溶剂萃取技术 HPLC测定C 用RIA时样品的预处理可粗放4 试验室条件A 试验室设备B 试验人员 C 验室SOPD 分析软件第二节分析方法建立的步骤一 分析方法的选择A 样品中的药物浓度是分析方法的首要因素B 样品中的药物浓度10 6 10 9g mlC HPLC法检测限 紫外 UV 1ng 荧光0 1ng 电化学 EDD 0 01ng二 分析方法的建立1 检测条件的筛选A 取标准物质待测物质 内标物质 B 根据已知的分析方法进行测定C 根据测定结果确定最佳条件 溶液pH值 温度及时间 试剂用量 色谱条件2 分析条件的选择1 空白溶剂试验A 取待测药物非生物基质溶液 按拟定的方法预处理 分析方法的特异性B 空白响应值应尽可能小或可忽略2 空白生物基质试验A 取空白生物基质 血 组织匀浆 照空白溶剂试验下操作B 考察杂质对测定的影响C 杂质不干扰测定 3 模拟生物样品试验A 取空白生物基质加入待测物制成模拟生物样品B 照空白生物基质试验下操作C 考察方法的专一性 线性范围 最小检测限 精密度 灵敏度 萃取回收率4 实际生物样品测定A 预试确定实际生物样品与模拟生物样品一致性B 正式试验按所建立的分析方法分析C 比较实际生物样品与模拟生物样品相应特点D 计算体内药物浓度 第三节分析方法的验证内容和要求一 分析方法的选择A 用于实际样品分析之前 对所建立的方法的可靠性 可行性 应使用若干技术指标验证B 验证步骤分析方法验证 实际生物样品中药物测定一 特异性 又称专属性 专一性 与选择性互用A 是指当有杂质存在时 方法准确测定待测物的能力 通常表示所检测的信号应属于待测物所特有B 用来验证该方法所测定的物质是目标物质 且不受非目标物质的干扰1 内源性物质的干扰 A 比较待测物的对照品 空白生物基质 模拟生物样品的检测信号 确证内源性物质对分析物有无干扰B 比较的内容Tr n T R2 代谢产物干扰比较模拟生物样品和实际生物样品的检测信号 Tr n T R 确证代谢产物对分析物有无干扰3 配伍用药的干扰A 比较待测药物 同时服用的药物 空白生物样本 待测药物模拟生物样品 待测药物 同时服用的药物模拟生物样品的检测信号 B 比较的内容Tr n T R4 与参比方法的相关性A 参比方法选择 HPLC GC B 同时用两种方法测定不同浓度的系列含药生物样品C 参比方法测得值为横坐标 x 拟定的方法测得值为纵座标 y 求回归方程y a bx r为一致成度 a为拟定方法受恒定干扰程度 b为拟定方法受比例干扰程度 D r 1a 0b 1两种方法一致二 标准曲线与线性范围A 又称校正曲线 工作曲线 是指生物样品中药物浓度与所测定的该药物的检测信号的相关性 通常用回归方程评价 B 大多数方法的标准曲线为线性模式 回归方法为最小二乘法和加权最小二乘法C 生物样品中药物浓度为自变量 x 检测信号为因变量 y 回归方程为y a bx r为相关系数D 线性范围 浓度不能外推E 标准曲线模拟生物样品的生物基质应使用与待测的实际生物样品的生物基质相同1 标准曲线系列溶液的配制1 精称标准药物适量 配贮备液2 精量配贮备液适量 配制系列标准溶液3 系列标准溶液浓度为模拟生物样品浓度的50倍 4 加量为生物样本体积的2 5 难溶药物 适当降低系列标准溶液浓度 蒸干6 线性模拟的标准曲线5 8点 线性模拟的标准曲线增加7 标准曲线系列浓度为等梯度 公比为22 内标物溶液的配制1 精称内标物适量 配内标物贮备液2 精量配贮备液适量 配制内标物标准溶液3 内标物标准溶液浓度为 标准曲线系列浓度 的中间浓度3 标准系列模拟生物样品的配制1 取空白血数份 加入 标准曲线系列浓度 适量 在加入内标液适量 混匀 2 标准系列模拟生物样品高低浓度比1 10 1 203 同时配制空白样C 04 防止生物基质中加入过多溶剂 干扰测定 可将标准液和内标液先加到试管中 蒸干后加生物基质4 标准曲线的绘制1 以待测物的响应值 A h 或与内标物的响应值的比 A1 A2 h1 h2 为 y 对浓度 x 回归得y a bx及r 绘制标准曲线 2 回归分析时在至少7个浓度构成的标准曲线中 至多2个浓度点数据因确切原因 离群 可剔出 余至少5点数据线性良好 5 限度要求1 标准曲线5 8浓度 最高和最低浓度比1 10 1 202 回归方程a应近于零 斜率b接近1或大于1 系数R接近1 HPLCR 0 99 生物学法R 0 98 3 需分区制备标准曲线 最高和最低浓度比 100 三 准确度指用该法测得的生物样 样品中待测药物的浓度与其真实浓度的接近程度 1 测定法取空白生物基质数份 照 标准曲线下 配制 至少选标准曲线的高 中 低3个浓度样品 每个浓度5个平行样 每个样测定一次 与随行的标准曲线同测定 2 结果计算与限度分析1 用随行的标准曲线计算测得浓度 内 外标 测得值M的平均值M平与配制理论值 A 比 计算回收率 RR 或相对误差 RE 2 RR M平 A 100 RE M平 A A 1003 RR在85 115 内 低浓度80 120 RE 15 低浓度 20 四 精密度指用1次测定结果与多次测定结果的平均值的偏离程度 表示分析方法的可重复性 1 表示方法方法精密度用SD或RSD表示 RSD SD X平均 1001 批内RSD又称日内RSD2 批内RSD又称日间RSD 2 测定方法1 批内RSDA 同一分析批 日内 B 随行标准曲线C 高 中 低3种浓度 每种浓度5个平行样 每样测定一次 D 计算日内RSD2 批间RSDA 5个工作日 每个工作日完成一个分析批测定B 每一个分析批随行1条标准曲线C 每一个分析批测高 中 低3种浓度样品 每种浓度1个样 每样测定1次 D 用随行的标准曲线计算日间RSD 3 限度要求药代动力学 生物利用度 g ml水平RSD 10 ng ml水平RSD 15 在最低检测浓度附近RSD 20 五 定量限A 方法定量限 LOQ 与检测限 LOD 均表示分析方法检测低浓度样的能力 通常称为方法灵敏度B LOD指在噪音水平下识别生物样本中药物的最低浓度C 当信噪比 S N 3时 该信号有效 将S N 3时样品的浓度作为LODD LOQ指保证具有一定可靠性的前提下 该方法能准确测定生物样品中药物的最低浓度E LOQ的检测响应值为LOD的两倍以上 为S N 10时的样品浓度 作为LOQ的估计值 F 体内分析中标准曲线的LOQ 估计LOQ1 测定方法取同一生物基质 制备至少5个独立的生物样本 其浓度应使S N 10 依法进行准确度 精密度验证2 限度要求A 生物样本测得的LOQ平均浓度在其表示浓度的 20 B 生物样本测得的LOQ其RSD 20 C LOQ小于测定3 5半衰期后生物样品中的药物浓度或小于Cmax的1 10六 稳定性1 方法稳定性 A 考察待测物的标准物 其分析溶液在室温 光照等稳定性B 方法建立过程中考察模拟生物样本预处理 室温或冰箱贮存 冻融等稳定性 2 生物样品稳定性1 短期稳定性考察模拟生物样品在室温 4 C或 20 C 冻融循环的稳定性2 长期稳定性考察实际生物样品经长期冰冻 20 C或 80 C 后稳定性 期限为从生物样本采集到分析完毕3 测定方要求1 测定方法与限度要求A 高 中 低3个浓度样本 置于适当的容器内 在不同 条件 不同存放时间后 每个样本重复测定3次以上 其平均值应在零时的 5 内 B 考察时间在一个工作日以上 则应与新制的样品在相同条件下的测得值比较 C 若生物样本的长期稳定性考察 可与液态氮中保存的生物样本 在相同条件的测定值比较2 稳定性期限要求A 在室温条件下仅需观察1日内稳定性B 在冰箱 4 C 20 C 80 C 中应考察数个工作日内的稳定性C 血浆冻融至少经历2个循环 冻 融 冻 融 以上 每次冷冻时间在24h以上 七提取回收率主要考察生物样本在制备过程中造成的待测组分的损失1 测定方法A 取空白生物基质数份 制备高 中 低3个浓度模拟样本 每种浓度5个平行样本 每个样本测定一次B 另取等量的相同3个浓度的标准溶液 进样测定C 计算AT AS 100 在相同条件的测定值比较D 提取回收率测定 若采用内标 内标物应在提取之后 溶剂挥发之前加入 溶剂挥发后测定E 内标法测定生物样品 应测定内标物的提取回收率 仅制备一个浓度 5个平行样本 同法测定 计算 2 限度要求A 待测物的提取回收率高 中 低3个浓度均 50 且高中的RSD 15 低浓度RSD 20 B 内标物提取回收率 50 RSD 15 八 质量控制1 质控 QC 样品A 将已知待测物加到空白基质中 配制的模拟生物样品 用于整个分析的质量控制 一般高 中 低3个浓度的质控样 B 质控样品池 试验研究初配制 与实际生物样相同条件下同时保存C 制备质控样品时 不能用制备标准曲线用的标准液 另配 2 质量控制A 未知样品的测定在方法确定后进行 每个样品测定一次 必要时复测