酵母蔗糖酶的提取及其性质研究ppt课件.pptVIP

1 学习酶的纯化方法 酶蛋白分离提纯的原理 2 学习掌握细胞破壁 有机溶剂分级和离子交换柱层析技术 本实验可以为大家提供一个较全面的实践机会 学习如何提取纯化 分析鉴定一种酶 并对这种酶的性质 尤其是动力学性质作初步的研究 酵母蔗糖酶的提取及其性质研究 1 自1860年Bertholet从啤酒酵母 SacchacomycesCerevisiae 中发现了蔗糖酶以来 它已被广泛地进行了研究 蔗糖酶 invertase D 呋喃果糖苷果糖水解酶 EC 3 2 1 26 特异地催化非还原糖中的 呋喃果糖苷键水解 具有相对专一性 不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖 也能催化棉子糖水解 生成蜜二糖和果糖 实验原理 2 本实验提取啤酒酵母中的蔗糖酶 该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧 在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶 其活力占蔗糖酶活力的大部分 是含有50 糖成分的糖蛋白 在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶 含有少量的糖 两种酶的蛋白质部分均为双亚基 二聚体 两种形式的酶的氨基酸组成不同 外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸 Ser和Met 它们的分子量也不同 外酶约为27万 或22万 与酵母的来源有关 内酶约为13 5万 尽管这两种酶在组成上有较大的差别 但其底物专一性和动力学性质仍十分相似 因此 本实验未区分内酶与外酶 而且由于内酶含量很少 极难提取 本实验提取纯化的主要是外酶 3 名称MW糖含量亚基为蔗糖的Km为棉子糖的KmpI最适pH稳定pH最适温度外酶27万50 双26mM150mM5 04 93 0 7 560 内酶13 5万 3 双25mM150mM5 04 56 0 9 060 实验中 用测定生成还原糖 葡萄糖和果糖 的量来测定蔗糖水解的速度 在给定的实验条件下 每分钟水解底物的量定为蔗糖酶的活力单位 比活力为每毫克蛋白质的活力单位数 两种酶的性质对照表如下 4 一 蔗糖酶的提取与部分纯化二 离子交换柱层析纯化蔗糖酶三 蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定 本实验共有三个分实验 5 细胞破壁的几种方法1 高速组织捣碎 将材料配成稀糊状液 放置于筒内约1 3体积 盖紧筒盖 将调速器先拨至最慢处 开动开关后 逐步加速至所需速度 2 玻璃匀浆器匀浆 先将剪碎的组织置于管中 再套入研杆来回研磨 上下移动 即可将细胞研碎 此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高 适用于量少和动物脏器组织 3 反复冻融法 将细胞在 20度以下冰冻 室温融解 反复几次 由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀 使细胞结构破碎 4 超声波处理法 用一定功率的超声波处理细胞悬液 使细胞急剧震荡破裂 此法多适用于微生物材料 5 化学处理法 有些动物细胞 例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠 SDS 去氧胆酸钠等细胞膜破坏 细菌细胞壁较厚 可采用溶菌酶处理效果更好 6 有机溶剂沉淀法 即向水溶液中加入一定量的亲水性的有机溶剂可降低溶质的溶解度使其沉淀被析出 一 蔗糖酶的提取与部分纯化 6 1 准备一个冰浴 将研钵稳妥放入冰浴中 2 称取2g干啤酒酵母 称10mg蜗牛酶及少量二氧化硅 放入研钵中 二氧化硅要预先研细 3 量取预冷的去离子水6ml 分两次 缓慢加入酵母中 边加边研磨成糊状 约需60分钟 研磨时用显微镜检查研磨的效果 至酵母细胞大部分研碎 4 缓慢加入预冷的10ml去离子水 每次加2ml左右 边加边研磨 至少用10分钟 5 将混合物转入1个离心管中 平衡后 用高速冷冻离心机离心 4 8000rpm 10min 如果中间白色的脂肪层厚 说明研磨效果良好 操作步骤 7 6 用滴管小心地取出上清 转入另一个清洁的离心管中 4 8000rpm 离心10min 7 将上清液转入量筒 量出体积 留出0 5ml测定酶活力及蛋白含量 剩余部分转入清洁离心管中 8 用广泛pH试纸检查清液pH 用1M乙酸将pH调至5 0 称为 粗级分I 2 热处理 1 预先将恒温水浴调到50 将盛有粗级分I的离心管稳妥地放入水浴中 50 下保温30分钟 在保温过程中不断轻摇离心管 2 取出离心管 于冰浴中迅速冷却 用4 8000rpm 离心10min 3 将上清液转入量筒 量出体积 留出0 5ml测定酶活力及蛋白质含量 称为 热级分II 8 3 乙醇沉淀将热级分II转入小烧杯中 放入冰浴 没有水的碎冰撒入少量食盐 逐滴加入等体积预冷至 20 的95 乙醇 同时轻轻搅拌 共需30分钟 再在冰浴中放置10分钟 以沉淀完全 于4 10000rpm 离心10min 量出体积 留出0 5ml 下次实验测定酶活力 后倾去上清 沉淀用2ml0 02MpH7 3的Tris HCl缓冲液充分溶解 保存于离心管中 盖上盖子 然后将其放入冰箱中冷冻保存 称为 醇级分 9 层析 层析法的基本原理 利用混合物中各组分物理化学性质的差异 如吸附力 分子形状及大小 分子亲和力 分配系数等 使各组分在流动相和固定相中的分布程度不同 并以不同的速度移动而达到分离的目的 mobilephase 携带样品流过整个系统的流体stationaryphase 静止不动的一相 10 层析法的分类 流动相有两种状态 液体作为流动相 气体作为流动相固定相也有两种状态 固体吸附剂作为固定相 以吸附在固体上的液体作为固定相按两相所处的状态分类 液相层析液 固层析液 液层析气相层析气 固层析气 液层析 11 按层析过程的机理分类 吸附层析 利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异 分配层析 利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数的不同 离子交换层析 利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同 凝胶层析 利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同 12 吸附层析 13 14 15 按操作形式不同分类 柱层析 将固定相装于柱内 使样品沿一个方向移动而达到分离 纸层析 用滤纸做液体的载体 点样后 用流动相展开 以达到分离鉴定的目的 薄层层析 将适当粒度的吸附剂铺成薄层 以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定 16 ColumnChromatography 17 离子交换层析 利用不同的蛋白质分子在溶液中所帶电荷不同 因而与离子交换树脂有不同的吸附力而分离改变溶液的pH值和盐离子浓度 结合力最小的蛋白质先洗脱下来 18 离子交换层析 sephoraseDEAEfastflow 离子交换层析技术是以离子交换纤维素或以离子交换葡聚糖凝胶为固定相 以蛋白质等样品为移动相 分离和提纯蛋白质 核酸 酶 激素和多糖等的一项技术 在纤维素与葡聚糖分子上结合有一定的离子基团 当结合阳离子基团时 可换出阴离子 则称为阴离子交换剂 如二乙氨乙基 Dicthylaminoethyl DEAE 在纤维素上结合了DEAE 含有带正电荷的阳离子纤维素 O C6H14NH 它的反离子为阴离子 如Cl 等 可与带负电荷的蛋白质阴离子进行交换 当结合阴离子基团时 可置换阳离子 称为阳离子交换剂 如羧甲基 Carboxymethy CM 纤维素 纤维素分子上带有负电荷的阴离子 纤维素 O CH2 COO 其反离子为阳离子 如Na 等 可与带正电荷蛋白质阳离子进行交换 19 离子交换剂 离子交换剂由载体 电荷基团和反离子构成 如羧甲基纤维素离子交换剂组成纤维素 O CH2 COO Na 载体电荷基团反离子 20 在适当的盐浓度下 溶液的pH值高于等电点时 蛋白质被阴离子交换剂所吸附 当溶液的pH值低于等电点时 蛋白质被阳离子交换剂所吸附 由于各种蛋白质所带的电荷不同 它们与交换剂的结合程度也不同 只要溶液pH值发生改变 就会直接影响到蛋白质与交换剂的吸附 从而可能把不同的蛋白质逐个分离开来 蛋白质的电荷性质 21 交换剂对胶体离子 如蛋白质 和无机盐离子 如NaCl 都具有交换吸附的能力 当两者同时存在于一个层析过程中 则产生竞争性的交换吸附 当Cl 的浓度大时 蛋白质不容易被吸附 吸附后也易于被洗脱 当Cl 浓度小时 蛋白质易被吸附 吸附后也不容易被洗脱 因此 在离子交换层析中 一般采用两种方法达到分离蛋白质的目的 一种是增加洗脱液的离子强度 一种是改变洗脱液的pH值 pH值增高时 抑制蛋白质阳离子化 随之对阳离子交换剂的吸附力减弱 pH值降低时 抑制蛋白质阴离子化 随之降低了蛋白质对阴离子交换剂的吸附 当使用阴离子交换剂时 增加盐离子 则降低pH值 当使用阳离子交换剂时 增加盐离子浓度 则升高溶液pH值 22 阴离子交换剂分离蛋白质的过程 平衡 吸附 去吸附 分离结束 再生 低盐 高盐 利用不同盐浓度将不同蛋白质洗脱下來 Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl 23 离子交换剂使用前一般要进行处理 干粉状的离子交换剂首先要进行膨化 将干粉在水中充分溶胀 以使离子交换剂颗粒的孔隙增大 具有交换活性的电荷基团充分暴露出来 而后用水悬浮去除杂质和细小颗粒 再用酸碱分别浸泡 每一种试剂处理后要用水洗至中性 再用另一种试剂处理 最后再用水洗至中性 这是为了进一步去除杂质 并使离子交换剂带上需要的平衡离子 市售的离子交换剂中通常阳离子交换剂为Na型 即平衡离子是Na离子 阴离子交换剂为Cl型 因为通常这样比较稳定 处理时一般阳离子交换剂最后用碱处理 阴离子交换剂最后用酸处理 常用的酸是HCl 碱是NaOH或再加一定的NaCl 这样处理后阳离子交换剂为Na型 阴离子交换剂为Cl型 使用的酸碱浓度一般小于0 5mol L 浸泡时间一般30min 处理时应注意酸碱浓度不宜过高 处理时间不宜过长 温度不宜过高 以免离子交换剂被破坏 另外要注意的是离子交换剂使用前要排除气泡 否则会影响分离效果 24 层析柱的制备与层析操作柱层析的设备 层析柱 蠕动泵 恒流泵 紫外检测仪 部分收集器 梯度洗脱器 25 26 层析设备 层析装置 梯度混和器蠕动泵层析柱监测仪记录仪收集器 27 低温层析柜 28 柱上操作 交换剂装柱最简单的交换层析柱可用碱式滴定管代替 处理过的树脂放入烧杯 加少量水边搅拌边倒入保持垂直的层析管中 使树脂缓慢沉降 交换剂在柱内必须分布均匀 上样向层析柱内倾入样品液 洗涤杂蛋白 4 洗脱与收集不同样品选用的洗脱液不同 原则是用一种比吸着物质更活泼的离子 把吸着物交换出来 由于被吸着的物质往往不是我们所要求的单一物质 因此除了正确选择洗脱液外还采控制流速和分布收集的方法来获得所需的单一物质 29 离子交换柱层析纯化蔗糖酶操作步骤1 离子交换剂的处理 DEAE SepharoseFastFlow离子交换剂保存在20 乙醇中 使用前去除乙醇后 用去离子水洗涤3 5次 DEAE SepharoseFastFlow层析柱柱料昂贵 用后务必回收 重复操作时 按 1mol LNaCl去离子水 的顺序洗即可 如果交换剂过度污染 再生时用0 5mol LNaOH浸泡30min 用蒸馏水洗到中性 再用1mol LNaCl浸泡30min 用蒸馏水洗到中性 最后保存在20 的酒精溶液中 30 2 装柱与平衡 先将层析柱垂直装好 在烧杯内用0 02mol LpH7 3Tris HCl缓冲液洗琼脂糖凝胶几次 装柱 然后用此缓冲液洗柱至流出液的电导率与缓冲液相同或接近时即可上样 一般洗2 3个柱体积 31 32 3 上样与洗脱 上样前先准备好梯度洗脱液 本实验采用30ml0 02MpH7 3的Tris HCl缓冲液和30ml含1MNaCl的0 02mol LpH7 3的Tris HCl缓冲液 进行线性梯度洗脱 取两个相同直径的50ml量杯 一个装30ml含NaCl的高离子强度溶液 另一个装入30ml低离子强度溶液 放在磁力搅拌器上 在低离子强度溶液的量杯内放入一个小搅拌子 使两杯溶液形成连通 注意两个杯要放妥善 切勿使一杯高 一杯低 33 用2ml0 02MpH7 3的Tris HCl缓冲液充分溶解醇级分 若溶液混浊 则用小试管 10000rpm离心除去不溶物 取1 5ml上清液 即醇级分 样品 留待下一个实验测酶活力及蛋白含量 将剩余的上清液小心地加到层析柱上 不要扰动柱床 注意要从上样开始使用部分收集器收集 每管3 0ml 3min 上样后用缓冲液洗两次 然后再用约20ml缓冲液洗去柱中未吸附的蛋白质 至A280降到0 1以下 夹住层析柱出口 将恒流泵入口的细塑料导管放入不含NaCl的低离子强度溶液的小烧杯中 接好层析柱 打开磁力搅拌器 放开层析柱出口 开始梯度洗脱 连续收集洗脱液 两个小烧杯中的洗脱液用尽后 为洗脱充分 也可将所配制的剩余30ml高离子强度洗脱液倒入小烧杯继续洗脱 控制流速3 0ml 3min 34 测定每管洗脱液的A280光吸收值 合并活性最高的2 3管 量出总体积 此即 柱级分IV 注意 从上样开始收集 可能有两个活性峰 梯度洗脱开始前的第一个峰是未吸附物 本实验取用梯度洗脱开始后洗下来的活性峰 35 各级分蛋白质含量的测定采用考马斯亮兰染料法 Bradford法 的微量法测定蛋白质含量 参见实验 蛋白质含量的测定法 各级分先要仔细寻找和试测出合适的稀释倍数 并详细记录稀释倍数的计算 使用移液管和量筒稀释 下列稀释倍数仅供参考 粗级分I 30倍热级分II 20倍醇级分III 3倍柱级分IV 2倍 36 蛋白质含量的测定 标准蛋白质浓度 1mg ml 37 实验结果计算 根据标准曲线求出稀释后的酵母蔗糖酶各级分的蛋白质浓度 mg ml 乘以稀释倍数 求出所提取的酵母蔗糖酶各级分的蛋白质浓度 mg ml 和总蛋白含量 乘以量取的各级分的上清体积 mg 38 酵母蔗糖酶各级分活性的测定 39 40 测定蔗糖酶活性的方法有许多种 如费林试剂法 Nelson s试剂法 水杨酸试剂法等 本实验先使用费林试剂法 费林试剂法灵敏度较高 但数据波动较大 因为反应后溶液的颜色随时间会有变化 因此加样和测定光吸收值时最好能计时 其原理是在酸性条件下 蔗糖酶催化蔗糖水解 生成一分子葡萄糖和一分子果糖 这些具有还原性的糖与碱性铜试剂混合加热后被氧化 二价铜被还原成棕红色氧化亚铜沉淀 氧化亚铜与磷钼酸作用 生成兰色溶液 其兰色深度与还原糖的量成正比 于650nm测定光吸收值 41 级分I II III蔗糖酶活性测定用去离子水代替稀释各级分酶液 试测出测酶活合适的稀释倍数 I 2000倍II 2000倍III 2000倍上清 不稀释IV 1000倍以上稀释倍数仅供参考 1 样10ul 水990ul100倍 2 0 5ml 1 水9 5ml20倍 1 样10ul 水990ul100倍 2 0 5ml 1 水4 5ml10倍 42 表1级分 的酶活力测定各管名称 对照粗级分 热级分 上清醇级分 IV葡萄糖管数 12345689酶液 ml 0 00 050 050 050 050 0500H2O ml 0 60 550 550 550 550 551 00 8乙酸缓冲液 0 2mol LpH4 9 0 20 20 20 20 20 200葡萄糖2mmol L00000000 2蔗糖0 2mol L0 20 20 20 20 20 200加入蔗糖 立即摇匀开始计时 25度准确反应10min后 立即加碱性铜试剂中止反应 碱性铜试剂1 01 01 01 01 01 01 01 0100 水浴加热8min 立即用自来水冷却磷钼酸试剂1 01 01 01 01 01 01 01 0H2O5 05 05 05 05 05 05 05 0A650nm 43 酶活力单位 酶 活力 单位 在一定条件下 一定时间内将一定量的底物转化为产物所需的酶量 U 在最适的反应条件 25 下 每分钟内催化一微摩尔底物转化为产物的酶量定为一个酶活力单位 即1U 1 mol min 在最适条件下 每秒钟内使一摩尔底物转化为产物所需的酶量定为1kat单位 即1kat 1mol s 1kat 6 107U 44 稀释后酶液的活力 按还原糖计算 E A650 0 2 2 A 650 10 B式中 A650 第2 6管所测A650A 650 第9管所测A6500 2 第9管葡萄糖取样量2 标准葡萄糖浓度2mmol L 2 mol ml10 反应10minB 每管加入酶液ml数 45 酶的纯度 总活力 活力单位数 mL酶液 总体积 mL 比活力 活力单位数 毫克蛋白 酶的纯化鉴定 聚丙烯酰胺凝胶电泳法 等电聚焦电泳法 46 计算各级分的比活力 纯化倍数及回收率 并将数据列于下表 级分IIIIIIIV记录体积 ml 蛋白质 mg ml 总蛋白 mg Units ml总Units比活力Units mg纯化倍数1回收率 100 纯化倍数 该步的比活力 第一次的比活力回收率 该步的总活力 第一次的总活力 47 试管用后清洗干净 倒置于试管架上 48 本实验是以蔗糖为底物 测定蔗糖酶与底物反应的时间进程曲线 即在酶反应的最适条件下 每间隔一定的时间测定产物的生成量 然后以酶反应时间为横座标 产物生成量为纵座标 画出酶反应的时间进程