荧光定量PCR详细流程和问题解

前一段时间在百度中搜索 发现多年前写的一个关于荧光定量 PCR 技术的 PPT 有很多人看过或 引用过 后来又听见一些认识的人也说 近来也就觉得自己对社会有点看得见的贡献了 考虑 到自己作为荧光定量 PCR 仪的技术支持人员已经工作了五年了 做的实验以及解决的问题远比 五年前多了 因此利用过年的时间 写点荧光定量 PCR 实验中的一些注意事项及感想 无论对 错 都是希望对相关的人员有些参考价值 荧光定量 PCR 原理等大家都已经很熟了 我就不细说了 主要是写一些有人问过的事 希望写 的内容是大家都关心的 普通 PCR 与荧光定量 PCR 技术区别 简单的讲 PCR 技术最早是用于扩增一段特异的 PCR 片段 用于克隆 测序等实验 后来也将 其用于样本中特异的 PCR 片段有无或非很粗的相对定量 而荧光定量 PCR 技术则是为了测定 样本中特异的 PCR 片段相对及绝对量 是一种测定特异的 PCR 片段含量的方式 如测定病人 样本中病原体的含量 实验样本中某一特定的 mRNA 的含量等 前些年有人讲过普通 PCR 后 通过电泳也可以进行定量 其实是将 PCR 产物的定量与 PCR 样 本中模板定量相混了 近两年没有人再讲这类的话了 Sybr Green Taqman Molecular beacon LUX 这些方法如何选择 从实验成本来讲 Sybr Green 是最好的 基本上就是普通 PCR 加上一点 Sybr Green I 荧光染 料即可 其信号强度也很好 还可以进行融解曲线分析等 但缺点是只能在一个反应管内进行 一种 PCR 反应的检测 另一个问题是非特异性扩增会影响实验结果 当然也有一些技术解决这 些问题 后面会讲到 对于研究人员来讲 如果需要检测的基因很多 而每个反应管中进行一 种 PCR 反应的检测可以满足实验要求 则 Sybr Green 是最好的选择 如果需要进行多通道实验 即在一个反应管中进行 2 种或以上的反应 则要选择其他的方法 最常用的是 Taqman Molecular beacon 这两种都是探针的方式 由于增加了探针的特异性 因此其扩增曲线反映的就是特异性产物的扩增曲线 不含有非特异性扩增的成分 因此商业用 途的检测试剂盒大都采用这一技术 以减少非特异性产物造成错误结论的可能性 其缺点在于 探针成本较高 有时设计的探针并不合适 有造成损失的可能性 并且要进行较多的实验条件 的优化 这两种探针技术用于商业目的时都有专利问题 据说取得 Molecular beacon 的许可权 的成本相对较低 但只是据说 另一种值得一提的是 LUX 探针 它也可进行多通道实验 但它没有 Taqman 和 Molecular beacon 方法的增加探针特异性的功能 因此只能是一种折中的方案 如果不考虑多通道实验 则不如 Sybr Green 法 选择单通道实验还是多通道实验 这是要根据实验需要来选择的 如果有一个 两个或是三个基因要进行比较 并用看家基因进 行对照 可以考虑选择多通道实验 多通道实验的好处是可以消除样本加样的误差 但要克服 的困难也比较多 一是条件的优化比较麻烦 即多种 PCR 反应以及探针要在同一个反应条件下 进行 并且效率都要比较高 另一个困难是要求相互之间没有干扰 因为干扰会影响到实验结 果 还有一个困难是当一个基因的模板数显著大于其他基因时 因为共用核苷酸等资源的原因 会让模板数少的基因的定量值变小或变为零 因此一般两通道的实验比较多些 即一个基因进 行多样本比较 用看家基因进行对照 可以看出 如果单通道实验可以解决问题 就不要选择多通道实验了 三个以上的基因进行比 较时就最好用单通道 因为一般的仪器最多也只有四个通道 就是有更多的通道 实验条件的 优化也是足够麻烦了 双通道实验时如何克服反应条件 干扰以及模板数差别很大等困难 对于反应条件的优化 可通过两个单独实验的标准曲线来优化 主要是复性温度 可用 PCR 仪 的温度梯度功能来选择 然后找到一个合适的复性温度 对于如何确定是否存在相互干扰 则 要通过两个独立的单通道实验与双通道实验的结果进行比较 如果差别不大 则表明没有干扰 至于模板数差别很大的问题 可以通过降低引物浓度的方法来实现 即 primer limited 在一般 的 PCR 反应中 引物的浓度是足够高的 基本上可以将反应液中的核苷酸全部消耗尽 在优化 引物浓度时 用不同的引物浓度进行实验 找到不影响反应的 C值的最低引物浓度 这样在 实际反应中 模板数高的基因在引物耗尽后 反应液中仍然有足够的核苷酸等用于另一个基因 的反应 引物设计中的几个注意事项 1 引物设计最好用相关的软件来进行设计 考虑引物自身回折 错配 引物二聚体 复性温 度 产物变性温度等问题 其中产物的变性温度是大家不太关心的问题 但有些产物在一般的 95 度条件下不能充分解链 会严重影响实验结果 2 引物所设计的片断一定要有足够的特异性 选择好片段后 最好到互联网中进行相关的搜 索 看在样本的基因组有没有相拟的基因以及假基因等 如果有 则可选择特异性更高的区域 3 在进行 mRNA 表达量的定量 可以在引物设计时考虑基因组的污染问题 即在引物设计时 让两个引物跨一个内含子 这样基因组污染所造成的扩增可以区别出来 或因为片段过大而不 能扩增 4 由于 mRNA 表达量的定量有一个逆转录的过程 如果逆转录是用 poly T 作引物 则设 计的片段尽量靠近 poly A 以免逆转录的效率影响到实验结果 如果用特异性引物进行逆 转录 则要考虑引物区是否存在 RNA 二级结构的问题 5 产物片段的大小 定量 PCR 一般产生片段都不大 不会超过 600bp Sybr Green 法一般选 择 250 600bp 过大会影响到 PCR 扩增的效率 过小则很难通过融解曲线与引物二聚体分开 但并不是绝对的 Taqman 法的扩增片段都很小 几十或是 100 多 这是其原理造成的 Molecular beacon 法对片段大小的要求不高 只要不是太长即可 Sybr Green 法的实验策略 实验可分为三个阶段 即实验条件的优化 预实验和正式实验 一 实验条件的优化阶段 这一阶段是最花时间的 1 要找到一个阳性的模板 可以是克隆有基因质粒 强阳性样本或纯化的 PCR 产物等 有了 阳性的模板才能进行最基本的定量扩增实验 如果有普通 PCR 的实验条件 也可以此为基础进 行实验 2 扩增出的产物要通过电泳方法确定其大小 以确认定量 PCR 扩增的产物是你的目的基因 有些用户就发生过优化了几天的条件才发现扩增片段的大小不对 不是自己想要的基因 当然 能测个序什么的最好 并通过融解曲线实验来确定产生的 Tm 值以及所用的变性温度是否已经 足够 个别情况下会出来解键不充分的现象 3 有了基本的 PCR 条件后 要将阳性模板进行倍比稀释 一般用 10 倍稀释 将稀释的模板 带上阴性对照 分成多份进行温度梯度实验 对复性温度进行优化 以找出复性温度范围 复 性温度最好能满足以下条件 高中低模板浓度下 PCR 扩增效率都很高 阴性模板没有扩增 选 择满足条件的中间温度 这样可以提高实验的稳定性 不会因为样本管在加热模块中的位置不 同而影响实验结果 4 如果找不到合适的条件 如引物二聚体过多 可对引物浓度 Mg2 离子浓度 DMSO 含 量等进行优化 然后再进行复性温度梯度实验 其中 Mg2 离子浓度 DMSO 含量都会影响 Tm 值以及所用的变性温度 二 预实验阶段 按照优化的条件对所需要分析的样本做一个没有重复的实验 每个样本做一个 10 倍和 100 倍 稀释的实验 预实验的目的主要有两个 一是了解样本的模板浓度范围 如果有样本的模板浓 度在标准曲线之外 如过高或过低 则可能要对标准曲线进行重新优化 当然 如果过高和过 低不影响你的实验结论则可定为高于多少或低于多少 直接进行外推是不科学的 另一个目的 看样本中是否有 PCR 抑制物的影响 如果每个样本的定量结果与其 10 及 100 倍稀释后的样本 的结果相同 则表明没有抑制物的影响 如果不同 如原倍结果为零 而 10 及 100 倍稀释后 的样本的结果为阳性 则表明样本中 PCR 抑制物浓度较高 可用其 10 及 100 倍稀释后的样本 进行定量 有几个用户发现过实验为阴性的样本在其 10 及 100 倍稀释后的样本为阳性的 也许有更多用 户没有进行这样的实验 得到了错误的结论 因为样本 RNA 的提取试剂中经常有抑制 PCR 反 应的物质 清洗不干净就会影响到定量 PCR 反应 三 正式实验阶段 然后就可以进行正式实验了 只需要将每个样本作三个或更多的重复即可以了 有抑制物的样 本先进行稀释 计算浓度时不要忘记就行了 最后就可以进行实验结果分析了 个别样本中离 群的数值可以删除 Sybr Green 法的注意事项 1 最好按照上面提到策略进行实验 以免造成不必要重复实验 从而降低实验成本 2 Sybr Green I 一般是先将母液用 DMSO 进行稀释 100 倍 最终的使用浓度为 4000 10000 分之一 可能不同的 Sybr Green I 母液的稀释倍数不同 可通过实验来证明 但高浓度的 Sybr Green I 肯定会影响 PCR 反应 另外用水稀释后的 Sybr Green I 保存的时间很短 一般 1 周后 就不能用了 DMSO 似乎反复冻融会影响性能 但原因不明 3 在对引物浓度 Mg2 离子浓度 DMSO 含量等进行优化后仍得不到满意的结果 特别是 引物二聚体很多时 可以考虑更换引物 因为引物成本低 而优化实验成本很高 4 当有少量引物二聚体影响荧光结果时 可以提高荧光读板时的温度来消除引物二聚体的影 响 如将读板时的温度提高到 82 度 此时引物二聚体已经解链而产物没有解链 但引物二聚 体浓度很高时会严重影响 PCR 反应 消除引物二聚体的影响也没有用 5 大家都知道进行绝对定量需要标准曲线 有些用户认为进行相对定量时就不需要标准曲线 了 可以通过 2 C t 来计算 但这一计算是有条件的 即所有荧光定量 PCR 扩增的效率都 接近于 100 可以通过实验来证明 但大多数用户并没有进行这样的实验就直接用 2 C t 来计算了 这是错误的 会得到错误结论 6 无论是使用自配的试剂还是用商业的荧光定量试剂盒 最好买够试剂 以免进行预实验或 正式实验时没有试剂而必需采用其他试剂 由于不同试剂的缓冲液成份有较大差别 如有的试 剂中含有 DMSO 及 Mg2 离子等 可能会影响到实验结果 甚至要重新进行实验条件的优化 7 不要在管盖上写字 原因很明显 但有些用户习惯了写字 后来再擦掉 也会对实验有些 影响 8 最好使用高质量的 PCR 管 低质量管的管间差可能会很大 9 每次实验一定要有阳性对照和阴性对照 以免出现问题时找不到原因 10 在样本很珍贵时可以采用对样本进行稀释的方式进行定量 只要浓度不是太低 理论来 讲对稀释是不会影响实验结果的 其他方法也可以采用类拟的策略 以节约成本 提高效率 想到的内容就这些了 希望大家多批评指正 反应体系的建立及优化 来源 作者 发布时间 2008 10 17 1 SG 浓度 终浓度 1 5 000 1 100 000 一般为 1 10 000 1 70 000 2 Primer 浓度 终浓度 50nM 300nM 固定摸板浓度的梯度实验 不加摸板的对照实验 NTC 有无非特异信号 熔解曲线的分析 是否单峰 建议使用 HPLC 纯化的引物 3 MgCl2 浓度 降低 MgCl2 浓度以减少非特异性产物 最低可至 1 5nM 同时做梯度实验和 NTC 对照 4 反应温度和时间参数 反应温度参考所用酶的种类 退火温度使用温度梯度功能优化 反应时间与常规 PCR 类似 扩增片断一般为 200 300bp 5 TaqMan 探针 引物 探针设计 首先选择探针序列 探针的 Tm 值为 68 70 度 长度不应超过 30 碱基 探针的 5 端不应是 G G 有可能会淬灭荧