李斯特菌对食品的污染及其防治

李斯特菌对食品的污染及其防治,一、概况：,李斯特氏菌是一种格兰氏阳性菌，形状为圆尾带柱，它是一种非芽孢兼性厌氧菌。 李斯特菌在环境中无处不在，在绝大多数食品中都能找到李斯特菌。肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都已被证实是李斯特菌的感染源。李斯特菌中毒严重的可引起血液和脑组织感染，很多国家都已经采取措施来控制食品中的李斯特菌，并制定了相应的标准。目前国际上公认的李斯特菌共有七个菌株：,单核细胞增生李斯特(L.monocytohenes) 绵羊李斯特菌 (L.iuanuii) 英诺克李斯特菌 (L.innocua) 威尔斯李斯特菌 (L.welshimeri) 西尔李斯特菌 (L.seeligeri) 格氏李斯特菌 (L.grayi) 默 氏 李 斯 特 菌 (L.murrayi),其中单增李斯特菌是主要能引起人类疾病的菌。单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。它能引起人、畜的李氏特菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。,二、李斯特菌的来源,、人首先，人能传播这种感染。特别是在医院里，通过人和人的接触尤易感染。据报道，健康人群粪便中lm的携带率为0.616%，有70的人可短期带菌。据有关研究表明，大约有到的健康人群携带有这个病菌。,、动物及环境李斯特菌传播给人类的主要途径是通过水源到厨房的食物链中的任何一个环节。它既能随食品原料进入食品加工厂，也可由灰尘或排泄物经工作人员带入，污染工作场所机机械设备，进而污染食品。直接或间接的接触动物，都有可能成为感染李斯特菌的来源。牛和羊类都能成为李斯特菌的携菌体。从环境方面来说，李斯特菌（）也广泛地存在于环境中。因此，食品从环境当中受到李斯特菌（）的机会是很大的。,从食品工厂来说，在后处理阶段，特别重要的是防止从工厂设施和机器中受到污染。 、食品食品能在食品链中的任何一个环节受到李斯特菌（）的污染，包括从原产地，到工厂的加工过程，进入分销环节，直致进入消费者的厨房。这个情况在那些潮湿气候的地区尤为显著。前已述及，李斯特菌可以在许多食品中得到感染，如牛奶、乳酪、生家禽和家畜肉、发酵香肠、蔬菜和海产品（48%）。,当然，有些食品被检出其它类型的非李斯特菌，可能不会引起人的感染，然而，其存在的事实勿庸置疑表明：操作过程的卫生状况需要立即加以改进。我们特别要注意，对于那些操作温度较高，保质期较短且常在冷藏条件下保存的食品通常都是李斯特菌的适宜生长环境。,三、控制因素,李斯特菌的感染最近呈上升趋势，在美国，报告有个感染例，然而，在年，这个数字却达到了。要想区分哪些李斯特菌的感染是来源于食品，或者说，分别区分出来源于食品或非食品，却是很困难的。原因是它有很长的潜伏期。根据记载，第一例确定由食品引起的李斯特菌感染在年，发生在加拿大的一次沙拉制品的较大规模的污染事件。,在那次事件中，有例被感染，例致死。根据调查，原因是其中的卷心菜受到了李斯特菌的污染。污染源又是通过做为肥料的羊粪而来。这些羊被怀疑感染了李斯特菌。其后，在美国、瑞士、英国、法国又相继发生了李斯特菌的污染事件。牵涉到的食品有牛奶、乳酪、猪肉、生乳制品等。因此,有效的控制和预防被提到了一个及其重要的位置。以下，列举一些重要的控制因素。,、温度李斯特菌是在能引起食品传染的致病菌中的比较特殊的一种。其原因是它属适冷细菌，李斯特菌能在2.542的温度下生存(有的资料讲在温度条件下能生长)，以时繁殖最快。李斯特菌能在冷冻产品中存活至几个星期，在酸性条件下较为困难。,、抗热性李斯特菌不是一种特别的抗热菌种，它不是芽孢菌，因此可以在巴氏灭菌的条件下被破坏。然而，相比较另一些食品致病菌，它的抗热性要好一些。根据实验，一套良好的灭菌乳系统能将生乳的控制在正常单位以下。对于肉制品而言，至少要保证和分钟以上的加热时间。如果加热过程不稳定，则可能减低杀菌效果。,、同其它细菌一样，李斯特菌在酸性条件下的存活能力取决于酸的种类和温度。通常能在小于的条件下得以生长，其中，李斯特菌得以生长的最低的值据记录是在。在冷藏条件下，它能生长的最低值线有所提高，据研究表明在。,、水分活性及盐李斯特菌单是一种能承受高离子浓度和低水分活性的菌种。它能够在的溶液内甚至更高的浓度下得以存活甚至生长；同时，也能在水分活性的条件下生长。其最低限随温度及溶剂的不同而稍有差异。 备注:水分活性AW来表示。其定义为食品所显示的水蒸汽压P对在同一温度下纯水的蒸汽压P0之比:Aw=P / Po水分子会从水中蒸发跑到空气中成为气体，即水蒸汽，而气体都有一定压力，水蒸汽的压力就称为水蒸汽压，一般食品不仅含有水，而且含有蛋白质，淀粉等固形物，所以它的水相对地就比纯水少，故其水蒸汽压也就小，即一般有PP0，所以AW值皆小于1。,、空气在微生物实验中，用肉汤培养基显示厌氧培养有助于的生长。同时，另一些实验表明在缺氧状态下，能在到的条件下在肉类中繁殖。同样，在的充二氧化碳的条件下，能在的条件下在不同种的蔬菜中得以生长。然而，高浓度的二氧化碳（）能抑制。,四、杀灭条件,该菌对理化因素抵抗力较强6070经520min可杀死，70酒精5min，2.5石炭酸（氢氧化钠，福尔马林）20min可杀死此菌。该菌对青霉素，四环素，磺胺均敏感。,五、监控频率,对加工环境较湿的应每周检测一次，较干的需每月监控一次。 若监控环境的检测结果不理想,则返回监控在一定时间内生产的产品,检测产品是否受到影响.,六、检验方法：,（一） 国标法 (常规法) 1、增菌培养取回的样品应在4下处理、存放和运送，如果是冷冻样品，则在检验前要保持冷冻状态。取25mL液体或25g半固体或固体样品放入含有225mL无选择性试剂增菌肉汤（EB）的均质杯中进行均质，然后转入三角瓶中，30培养4h，加入选择性试剂吖啶黄素、萘啶酮酸和放线菌酮，继续培养20h和44h.。,2、分离共培养24h和48h后，取EB培养物分别在OXA和LPM或加七叶苷/Fe3+LPM琼脂平板上划线。PALCAM琼脂可替代LPM琼脂。将OXA和PALCAM平板置于35培养24-48h，LPM平板在30培养24-48h。然后，把LPM平板放于解剖镜载物台上，以450角入射光从平板下面照射平板，通过目镜垂直向下观察寻找可疑菌落。李斯特氏菌在LPM平板上呈有光泽的兰色或灰色。用已知阳性菌和阴性菌划线的平板作对照。,加入七叶苷和Fe3+的LPM平板不用斜射光系统，选择可疑菌落的方法与在OXA上选择可疑菌落的方法相同。在OXA平板上李斯特氏菌菌落周围有一个黑色环，其它菌也可形成黑色环，但形成时间要在两天以上。李斯特氏菌在PALCAM和OXA平板上的菌落特征相似。,在PALCAM和OXA或LPM平板上挑取5个或更多的典型菌落，分别划线于TSAYE平板上以得到更纯、更典型的单个菌落。食品检验中在TSAYE平板上纯化是必须的，因为在PALCAM和OXA或LPM平板上分离菌落时可能沾有不可见的受抑微生物。挑取5个典型菌落的原因是一个样品中可能分离到一种以上的李斯特氏菌。30TSAYE平板培养24-48h，如果不用于动力观察，也可在35培养。,3、鉴定步骤（1）观察TSAYE平板通过斜射光观察，寻找呈兰灰至兰色菌落。在TSAYE上用已知菌作对照。（2）、从30或更低温度下培养的TSAYE平板上挑取典型菌落做成湿玻片在油镜下观察。湿玻片用0.85%生理盐水菌悬液制成。如果菌量太少，菌体黏附于载玻片上而呈现非运动性。李斯特氏菌是细短杆菌，可见轻微的旋转及翻滚。与已知的李斯特氏菌的对照相比，球形、大的杆状且快速泳动的都不是李斯特氏菌。,（3）挑取典型菌落进行过氧化氢酶实验，李斯特氏菌呈过氧化氢酶阳性反应。（4）取16-24h的培养物进行革兰氏染色，李斯特氏菌呈革兰氏阳性杆菌。但是陈旧培养物革兰氏染色会发生变化，而且菌体可成球形。在染色过重的玻片上菌体有呈栅状排列的趋势，易误认为白喉菌而错判。,（5）挑取典型菌落接种于TSBYE肉汤管中，35培养24h用做糖类发酵和其它生化项目实验。TSBYE肉汤管在4下可存放几天，也可反复接种。（6）在TSAYE平板上挑取典型菌落刺种到5%的绵羊血或马血琼脂平板上，刺种时避免触到平板底部和使琼脂破裂，同时设阳性对照（单核细胞增生李斯特氏菌和绵羊李斯特氏菌）和阴性对照（英诺克李斯特氏菌），35培养48h。单核细胞增生李斯特氏菌呈窄小的-溶血环。,（7）在明亮的光照下，观察经穿刺的血琼脂平板，单核细胞增生李斯特氏菌和西尔李斯特氏菌围绕穿刺点产生较清晰的-溶血环，英诺克李斯特氏菌不产生溶血现象，而绵羊李斯特氏菌产生界限明显的较大溶血环，在此不要试图进行种间的区分，但要记录下溶血反应的特征，CAMP试验可区分它们间的溶血反应。,（8）硝酸盐还原试验（选做）。用TSBYE肉汤培养物接种于硝酸盐肉汤中，35培养5天后，加入0.2mL试剂A，再加入0.2mL试剂B，混合，出现紫红色为阳性反应，表明硝酸盐已被还原，如无颜色出现，在试管内再加入少量锌粉，放置1h，如出现紫红色，表明硝酸盐仍存在，未被细菌还原。只有默氏李斯特氏菌还原硝酸盐，因此，从格氏李斯特氏菌中区分出默氏李斯特氏菌就必须进行这唯一的试验。,本试验还有一等效试验，即加入0.2mL试剂A后，再加入0.2mL试剂C，出现橙色表明硝酸盐已被还原。如未出现颜色反应，也加入少量锌粉，若出现橙色表明硝酸盐未被还原。,（9）将TSBYE培养物穿刺到SIM和MTM试管中，室温培养7天，每日观察，李斯特氏菌呈典型伞状生长。在MTM中伞状生长更典型。同时，30的TSBYE培养物在油镜下可见细菌作翻转运动。,（10）将TSAYE肉汤培养物分别接种于0.5%（W/V）葡萄糖、麦芽糖、七叶苷、甘露醇、鼠李糖、木糖发酵管内（可选用倒立发酵管），35培养7天，呈阳性反应的李斯特氏菌产酸不产气。所有李斯特氏菌对葡萄糖、七叶苷、麦芽糖均能发酵，除格氏李斯特氏菌均不能发酵甘露醇。如果在OXA、PALCAM或加七叶苷/Fe3+的LPM分离平板上菌落色素很明显，则七叶苷试验可免做。,4、李斯特氏菌属的区别将TSBYE肉汤培养物接种到3mLTSBYE肉汤中，35培养24h，接种2支TSAYE琼脂斜面，35培养24h。用3mL0.01mol/l磷酸盐缓冲液将斜面菌苔洗下，菌悬液于80水浴中加热1h，以2500r/min离心30，弃去2mL上清夜，将剩余液与沉淀混匀制成菌悬液，进行血清学玻片凝集试验。,5、小鼠毒力试验将分离的菌株接种到10 mL TSBYE肉汤中，35培养24h，将培养物离心、浓缩，用1mL生理盐水制成菌悬液（浓度为1010个菌/mL），取0.1mL腹腔注射体重为16-18g 小鼠，每组5个观察7d内小鼠死亡情况。用已知致病的单增李斯特氏菌和非致病的英诺克李斯特氏菌相同方法进行，做对照试验。,6、协同溶血（CAMP）试验在羊血琼脂平板上平行接种-溶血金黄色葡萄球菌（S.aureus）和马红球菌(R.equi),在它们中间垂直划线接种可疑菌，与两线相近但不相交，在30培养24h-48h,检查平板中垂直接种点对溶血环的影响。靠近金黄色葡萄球菌接种点的单增李斯特氏菌的溶血增强，西尔李斯特氏菌的溶血也增强，绵羊李斯特氏菌在马红血球附近的溶血增强。,(二) 免疫学检测方法,1、 自动酶联荧光免疫检测系统（VIDAS） 分析方法自动酶联荧光免疫检测系统（VIDAS）分析方法是对李斯特菌属全部种的筛检，VIDAS LMO则是对李斯特菌属中主要致病菌单增李斯特菌的筛检。,原理 ：李斯特菌的抗原鉴别是基于在VIDAS仪器内进行的酶联荧光免疫分析。像吸液管的装置是固相容器（SPR），在分析中既作为固相也作为吸液器。SPR包被有高特异的李斯特菌抗体。分析用试剂均密封于试剂条内，分析的每一步都是自动执行的。煮沸一定量的增菌肉汤加入试剂条，肉汤中的混合物在特定时间内循环于SPR内外。如果有李斯特菌抗原存在则与包被在SPR内的单克隆抗体结合，其他没有结合上的化合物被冲洗掉。,结合有碱性磷酸酶的抗体在SPR内外循环与结合在SPR内壁上的李斯特菌抗原结合，最后的冲洗步骤将没有结合的接合剂冲洗掉。底物4-甲基伞形磷酸酮被SPR壁上的酶转换成荧光产物4-甲基伞形酮。荧光强度由光学扫描器测定。实验结果由计算机自动分析，产生基于荧光测试的试验值与标准相比较后打印出每一个被测样品的阳性或阴性结果报告,混合知识,一、细菌的种类。,致病菌的生长特征和来源是进行危害分析的基础。根据细菌有无芽孢分类可分为革兰氏阴性杆菌和革兰氏阳性球菌和杆菌。,1）革兰氏阴性杆菌。不产芽孢，主要来源于粪便。空肠弯曲杆菌（Campylobacter spp.）；耶尔森氏肠球菌（Burcella abortis）；沙门氏菌属（Salmonlella spp.）如鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium）、肠炎沙门氏菌（S.enteriditis）；志贺氏菌属（Shigella spp.）；大肠埃希氏杆菌（Pathogenic escherichia coli），如O157：H7大肠杆菌（E.coliO157H7）。,2）革兰氏阳性球菌和杆菌。产生芽孢，与环境（如土壤污泥）相关的弧菌（Vibrio spp.）；蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes）、产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）、肉毒梭菌（Clostridium botulinum）、金黄色葡萄球菌（Pathogenic staphylococcus aureus）。,弧菌属，如霍乱弧菌、副溶血性弧菌、其他弧菌、单核细胞增生性李斯特菌属海产品中自身原有的细菌；沙门氏菌、志贺氏菌、致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球属海产品中的非自身原有的细菌。,芽孢是细菌在生命中周期中处于休眠阶段的生命体，相对于其生长状态下营养细胞或其他非芽孢菌而言,对化学杀菌剂、热力或其他加工处理具有极强的抵抗能力。处于休眠状态下的芽孢是没有危害的，但一旦食品中残留的致病性芽孢菌的芽孢在食品中萌芽、生长，即会成为危害，使食品不安全。因此，对此类食品的微生物控制必须以杀灭芽孢为目标，显然用于控制芽孢的加工步骤要比控制非芽孢菌需要的条件要严格得多。,二、大肠杆菌O157：H7,（一）概述 1、 什么是大肠菌群？大肠菌群名称并非细菌分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化反应及血清学方面并非完全一致。,大肠菌群：需氧及兼性厌氧，在37能分解乳糖，产酸，产气的革兰氏染色阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括：大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。目前已被国内外广泛应用于评价食品卫生质量的重要指标之一。,2、 什么是大肠杆菌？埃希氏菌属的代表菌种是大肠埃希氏菌。大肠埃希氏菌俗称大肠杆菌，它是人类和动物肠道正常菌群的成员，随粪便排到自然界，并污染食品，本菌是组成水、食品中大肠菌群成员之一，其数目多少代表粪便污染和程度。,能引起肠道感染的大肠埃希氏菌有下列五个病原群(1)肠产毒性大肠埃希氏菌(ETEC)产生ST、LT、引起婴儿、旅游者腹泻。(2)肠致病性大肠埃希氏菌(EPEC)寄居十二指肠、回肠、空肠。引起婴儿腹泻。(3)肠侵袭性大肠埃希氏菌(EIEC)有侵袭力，痢疾样症状。,(4)肠出血性大肠埃希氏菌(EHEC)引起出血性结肠炎，主要菌型O157。(5)肠粘附性大肠埃希氏菌(EAEC)损害肠细胞外毒素，引起小儿顽固性腹泻,3、 什么是大肠杆菌O157：H7？ EHEC O157:H7属于肠杆菌科埃希氏菌属。它是肠出血性大肠杆菌(EHEC)的主要血清型。,(二)、流行特点：1.季节性：多发生于夏秋两季6-9月为发病高峰。11月至次年2 月极少发病。2.地区分布：多发生于发达国家，主要以散发性为主。3.易感人群：儿童5-9岁、老人50-59岁明显高于其它年龄组，最小3个月，最大85岁。,4.宿主：农场动物牛、羊、猪、鸡、马、鹿、鸽子、海鸥等均可能为大肠杆菌O157的携带者。5.食源性E.coli O157:H7感染：牛肉、生奶、鸡肉及其制品，蔬菜、水果及制品等均可引起污染，其中牛肉是最主要的传播载体。,（三）、生物学特征 1.形态与染色：革兰氏染色阴性，无芽胞，有鞭毛。2.培养特性：最适生长温度为33-42，37繁殖迅速，44-45生长不良，45.5停止生长。3.抵抗力：具有较强的耐酸性，pH2.5-3.0，37可耐受5小时；耐低温，能在冰箱内长期生存；在自然界的水中可存活数周至数月；不耐热，751分钟即被灭活；对氯敏感，被1mg/L的余氯浓度杀灭。,4.生化反应：除不发酵或迟缓发酵山梨醇外，其他常见的生化特征与大肠埃希氏菌基本相似，但也有某些生化反应不完全一致。5.EHEC除其代表菌株O157:H7外，还包括O157:NM、O26:H11、O111:H8、O125:NM、O121:H19、O45:H2、O4:NM、O145:NM、O5:NM、O91:H21、O103:H2、O113:H2等血清型的部分菌株。血清学鉴定包括O抗原和H抗原的鉴定。前者可使用玻片凝集试验或胶乳凝集试验；后者则应先进行动力试验，动力活泼者再进行玻片和试管凝集试验。,（四）、致病性：,致病因素：E.coli O157:H7的另一个显著特征是可产生大量的Vero毒素（VT），也称作类志贺氏毒素（SLT），是EHEC的主要致病因子。,（五）、E.coli O157:H7的检验1、 E.coli O157:H7快速酶触反应显色培 养基法,快速酶触反应是根据细菌在其生长繁殖过程中可合成和释放某些特异性的酶，按酶的特性，选用相应的底物和指示剂，将它们配制在相关的培养基中。根据细菌反应后出现的明显的颜色变化，确定待分离的可疑菌株，反应的测定结果有助于细菌的快速诊断。这种技术将传统的细菌分离与生化反应有机的结合起来，并使得检测结果直观，成为今后微生物检测发展的一个重要发展方向。,2、聚合酶链反应(PCR)技术PCR技术原理为提高DNA探针的敏感性，可先将靶 DNA序列扩增，增加 DNA数量，使其达到足够的检测量，若反应以动力学为基础，则能定量分析。1983年 Millus和 Cetus发明了最基本的扩增 DNA或增加样品中特殊核苷酸片段数量的方法-聚合酶链反应即PCR法。,PCR法建立在三步重复发生反应的基础上。通过热处理将双股DNA变性裂解成单股DNA；退火延伸引物至特异性寡核苷酸上；酶促延伸引物与DNA配对合成模板，引物退火，变性DNA片段，引物杂交形成的模板可参与再次反应。溶液中核苷酸通过酶聚合成相互补对的DNA片段，并能重新裂解成单股DNA成为下次PCR复制的模板。,三、沙门氏菌,（一）、 传播途径大多通过吃进被沙门氏菌污染的食品，吃感染了沙门氏菌的动物内脏及蛋，人传给人。1、肉的污染：肉及其制品的沙门氏