实验名称-碱性磷酸酶的分离纯化实验报告

实验名称 碱性磷酸酶的分离纯化 比活性测定与动力学分析 实验日期 2011 年 10 月 25 号 实验地点 生化实验室 合作者 指导老师 总分 教师签名 批改日期 碱性磷酸酶 AKP 或 ALP 是一种底物特异性较低 在碱性条件下能水解多重磷酸单 脂化合物的酶 需要镁和锰离子为激活剂 AKP 具有磷酸基团转移活性 能将底物中的磷 酸基团转移到另一个含有羟基的接受体上 如磷酸基团的接受体是水 则其作用就是水解 AKP 最适 范围为 动物中 AKP 主要存在于小肠粘膜 肾 骨骼 肝脏和 胎盘等组织的细胞膜上 血清 AKP 主要来自肝 小部分来自骨骼 AKP 可从组织中分离纯化 也可以采用基因工程表达的方式获得 将碱性磷酸酶基因克隆 到重组载体 转入宿主菌中进行重组表达 并从表达菌提取 并进行酶动力学分析 一一 实验原理实验原理 1 碱性磷酸酶的分离纯化 碱性磷酸酶的分离纯化 AKP 分离纯化的方法与一般蛋白质的分离纯化方法相似 常用中性盐盐析法 电泳 法 色谱法 有机溶剂沉淀法等方法分离纯化 有时需要多种方法配合使用 才能得到高 纯度的酶蛋白 本实验采用有机溶剂沉淀法从兔肝匀浆液中提取分离 AKP 正丁醇能使部 分杂蛋白变性 过滤除去杂蛋白即为含有 AKP 的滤液 AKP 能溶于终浓度为 33 的丙酮 或 30 的乙醇中 而不溶于终浓度为 50 的丙酮或 60 的乙醇中 通过离心即可得到初步 纯化的 AKP 2 碱性磷酸酶的比活性测定 碱性磷酸酶的比活性测定 根据国际酶学委员会规定 酶的比活性用每毫克蛋白质具有的酶活性来表示 单位 U mg pr 来表示 因此 测定样品的比活性必须测定 a 每毫升样品中的蛋白质毫克 数 b 每毫升样品中的酶活性单位数 酶的纯浓度越高酶的比活性也就越高 本实验以磷 酸苯二钠为底物 由碱性磷酸酶催化水解 生成游离酚和磷酸盐 酚在碱性条件下与 4 氨 基安替比作用 经铁氰化钾氧化 生成红色的醌衍生物 颜色深浅和酚的含量成正比 于 510nm 处比色 即可求出反应过程中产生的酚含量 而碱性磷酸酶的活性单位可定义为 在 37 摄氏度保温 15min 每产生 1mg 的酚为一个酶活性单位 样品蛋白质含量测定用 Folin 酚法测定 3 底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响 底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响 在环境的温度 和酶的浓度一定时 酶促反应速度与底物浓度之间的关系表现为 反应开始时 酶促反应的速度 随底物浓度 的增加而迅速增加 若继续增加底 物浓度 反应速度的增加率将减少 当底物浓度增加到某种程度时 反应速度就会达到一 个极限值 即最大反引发速度 Vmax 底物浓度与酶促反应速度的这种关系可用米氏方 程式表示 式中 Vmax 为最大反应速度 S 为底物浓度 Km 为米氏常数 V 代表反应的起始速 度 当 Vmax 2 时 Km S 因此 Km 等于酶促反应速度达最大值一半时的底物 浓度 Km 是酶的最重要的特征性常数 测定 Km 值是研究酶动力学的一种重要的方法 大 多数酶的 Km 值在 0 01 100mmol L Km 和 Vmax 的测定 主要采用 Lineweaver Burk 双倒数作图法 此式为直线方 程 以不同的底物浓度 1 S 为横坐标 以 1 V 为纵坐标 并将各点连成一直线 向纵 轴方向延长 此线与横轴相交的负截距为 1 Km 由此可以正确球的该酶的 Km 值 方程式与图如下 本实验以碱性磷酸酶为例 测定不同底物浓度时的酶活性 再根据 Lineweaver Burk 法 作图计算其 Km 值 实验以磷酸苯二钠为底物 由碱性磷酸酶催化水解 生成游离 酚和磷酸盐 酚在碱性条件下与4 氨基安替比林作用 经铁氰化钾氧化 生成红色 的醌衍生物 颜色深浅和酚的含量成正比 根据吸光值得大小可以计算出酶的活性 也可以从标准曲线上差得酚的含量 进而算出酶活性的大小 二 实验材料二 实验材料 一 碱性磷酸酶的分解纯化和比活性测定 一 碱性磷酸酶的分解纯化和比活性测定 样品 兔肝 试剂 0 5mol L 乙酸镁溶液 0 1mol L 乙酸钠溶液 0 01mol L 乙酸镁 0 01mol L 乙酸钠溶液 0 01mol L Tris 0 01mol L 乙酸镁 PH 缓冲液 丙酮 分析纯 95 乙醇 分析纯 正丁醇 分析纯 0 04mol L 底物液 mg ml 分标准液 0 5mol L 0 3 4 氨基安替比林 0 5 铁氰化钾 0 1mg mL 蛋白标准液 碱性铜试剂 酚试剂 仪器与器材 研钵 刻度离心管 刻度吸管 电动离心机 玻璃漏斗和玻璃棒 托盘天平 恒温水浴 可见分光光度计 二 底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响 二 底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响 样品 兔肝匀浆液 试剂 0 04mol L 底物液 0 1 mol L 碳酸盐缓冲液 PH10 37 碱性溶液 0 5 铁氰化钾 0 3 4 氨基安替比林 酚标准液 0 1mg ml 仪器与器材 恒温水浴锅 可见光分光光度计 三 实验步骤三 实验步骤 一 一 AKP 的提取的提取 AKP 提取实验步骤 步骤操作 匀浆2g 新鲜兔肝剪碎 加入 0 01mol L 乙酸镁 0 01mol L 乙酸钠溶液 6 0ml 研磨 成匀浆 匀浆倒入刻度离心管中 记录其体积 此为 液 吸取 液 0 1ml 于另一试管中 加 PH8 8Tris 缓冲液 4 9ml 稀释 此为稀释 液 1 50 供此比活性用 除杂蛋白在 液中加入正丁醇 2 0ml 用玻璃棒充分搅拌 2min 室温放置 20min 用滤 纸过滤 丙酮沉淀 AKP滤液置于刻度离心管中 加入等体积的冷丙酮 立即混匀离心 2000r min 5min AKP 溶解沉淀加入 0 5mol L 乙酸镁 4 0ml 用玻璃棒充分搅拌使其溶解 记录其体积 此为 B 液 取 B 液 0 1ml 于另一试管中 加入 PH8 8Tris 缓冲液 4 9ml 此为 稀释 B 液 1 50 供动力实验用 二二 AKP 的比活性测定的比活性测定 1 AKP 的活性测定 AKP 活性测定实验步骤 步骤操作 1 加缓冲液 取试管 3 支 按表操作 试剂 ml 测定管标准管空白管 PH8 8Tris 缓冲液 1 0 0 04mol L 底物液1 01 01 0 2 温浴 37 水浴预温 5min 3 加酶和底物 1 0 0 1mol ml 标准酚 应用液待测液1 0 4 酶促反应 37 准确保温 15min 5 加显色液0 5mol LNaOH1 01 01 0 0 3 4 氨基安替 比林 1 01 01 0 0 5 铁氰化钾2 02 02 0 6 显色反应混匀 室温放置 10min 7 测吸光度510nm 处测吸光度 2 蛋白质含量测定 蛋白质含量测定实验步骤 步骤操作 1 反应体系 设置 取 3 支试管 按表操作 试剂测定管标准管空白管 PH8 8Tris 缓冲液 1 0 待测酶液1 0 蛋白标准液 0 1mg ml 1 0 碱式铜试剂5 05 05 0 2 反应混匀后室温放置 10min 3 加酚试剂酚试剂 0 5ml 4 显色反应混匀后室温放置 30min 5 比色反应在 510nm 处比色 三 底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响 三 底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响 1 底物浓度对酶促反应速度的影响 将新鲜兔肝用 PH10 0 0 1mol L 碳酸缓冲液匀浆 按 20 倍稀释即可 酶曲线绘制步骤 步骤操作 1 反应体系设置取 6 支试管标号 按表操作 试剂 ml 123456 0 01mol l 底物液0 010 200 300 501 00 PH10 0 1mol L 碳 酸盐缓冲液 0 070 700 700 700 700 70 蒸馏水1 101 000 900 700 201 20 2 保温 37 水浴中保温 5min 3 加酶各管分别加入兔肝稀释匀浆液 0 10ml 4 酶促反应混匀 立即记录时间 将各管准确保温 15min 5 终止反应各管分别加入碱性溶液 1 0ml 各管分别加入 0 3 4 氨基安替比林 1 0ml 6 加显色剂 各管分别加入 0 5 铁氰化钾 2 0ml 7 显色充分混匀 放置 15min 8 比色测定以 6 号空白管作对照 于 510nm 波长处比色测定 9 反应速度计算根据酚标准曲线计算出每样品酚的含量 算出反应速度 10 曲线绘制以各管底物浓度的倒数 1 S 为横坐标 以各管反应速度的倒数 1 V 为纵坐标 作图求出 Km 值 2 酚标准曲线的绘制的绘制 酚标准曲线的绘制的绘制步骤 步骤操作 1 反应体系设置取洁净干燥试管 6 支 依次加入试剂 试剂 ml 123456 0 1mol ml 酚标 准溶液 0 050 100 200 300 40 蒸馏水2 01 951 901 801 701 60 2 预加热 37 水浴中保温 5min 3 加显色剂碱性溶液1 01 01 01 01 01 0 0 3 4 氨基1 01 01 01 01 01 0 安替比林 0 5 铁氰化钾2 02 02 02 02 02 0 4 显色反应混匀后 室温放置 15min 5 比色测定510nm 波长处比色 6 曲线绘制以酚含量 微