质粒DNA的提取和纯化实验报告

实验一 质粒实验一 质粒 DNADNA 的提取和纯化的提取和纯化 一 实验目的 1 学习并掌握碱裂解法小量制备质粒 DNA 的方法 2 初步了解 DNA 纯化的原理 二 实验原理 1 细菌质粒是一类双链 闭环的 DNA 大小范围从 1kb 至 200kb 以上不等 各种质粒都是存在于细胞质中 独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份 通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态 但在一定条件下也会可逆 地整合到寄主染色体上 随着染色体的复制而复制 并通过细胞分裂传递到后 代 2 质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子 重要的条件是可获得大量 纯化的质粒 DNA 分子 目前已有许多方法可用于质粒 DNA 的提取 本实验采 用碱裂解法提取质粒 DNA 3 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒 DNA 的方法 其基本原理为 当 菌体在 NaOH 和 SDS 溶液中裂解时 蛋白质与 DNA 发生变性 当加入中和液后 质粒 DNA 分子能够迅速复性 呈溶解状态 离心时留在上清中 蛋白质与染色 体 DNA 不变性而呈絮状 离心时可沉淀下来 4 纯化质粒 DNA 的方法通常是利用了质粒 DNA 相对较小及共价闭环两个性 质 例如 氯化铯 溴化乙锭梯度平衡离心 离子交换层析 凝胶过滤层析 聚 乙二醇分级沉淀等方法 但这些方法相对昂贵或费时 对于小量制备的质粒 DNA 经过苯酚 氯仿抽提 RNA 酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白 质和 RNA 所得纯化的质粒 DNA 已可满足细菌转化 DNA 片段的分离和酶切 常规亚克隆及探针标记等要求 故在分子生物学实验室中常用 三 实验步骤 1 挑取单菌落接种到含 Amp 的 LB 液体培养基试管内 3 5ml 管 2 将试管放入恒温震荡培养箱中 37 200r min 培养 12 16h 3 将菌落转入 1 5ml 离心管中 尽量倒满 1200r min 离心 30s 沉淀菌体 4 重复一次第三步的过程 5 弃掉上清液并扣干 加入预冷的 Solution1 100 微升 剧烈震荡打散菌体 6 加入新配置的 Solution2 200 微升 温和颠倒试管 6 7 次混匀 室温放置 5min 使液体由浑浊变为透明粘稠 7 加入预冷的 Solution3 150 微升 温和颠倒离心管 2 3 次 震荡 7 8 次 之后 在 1200r min 离心 7min 8 小心将含有质粒 DNA 的上清液转移到另一离心管中 400 500 微升 9 加等体积的氯仿 轻微震荡 1200r min 离心 2min 之后将上清液转移至另 一离心管 10 加入 2 倍体积冰冷无水乙醇 轻轻颠倒离心管混匀 室温放置 2min 1200r min 下离心 10min 11 弃上清 加入 70 乙醇洗涤沉淀 12000r min 离心 2min 弃上清 12 弃上清 液体尽量倒净 并在吸水纸上扣干 室温静置 15min 干燥 13 加入 1 TE 40 微升溶解质粒 用于定量分析 电泳检测等 实验二 实验二 DNADNA 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 一 实验目的 1 学习 DNA 琼脂糖凝胶电泳的使用技术 2 掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法 二 实验原理 1 关于电泳技术 电泳常用于分离和纯化那些分子大小 电荷性状或分个构 象有所不同的生物大分子 尤其是蛋白质和核酸 正因为如此 电泳已成为 生物化学和分子生物学中应用最为广泛的技术之一 其中在分子生物学实验中 最为常用的是琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是一种海藻多糖 琼脂糖胶分离范围 很大 但其分辨率却相对较低 通过改变琼脂糖凝胶的浓度 应用标准的电泳 技术可以分离 200 到 50 000 bp 大小的 DNA 片断 一般琼脂糖胶浓度在 0 5 到 4 之间 且琼脂糖凝胶浓度越大 凝胶就越硬 较高浓度的琼脂糖胶有利 于较小的 DNA 片断分离 而较低浓度的琼脂糖胶则可以分离较大的 DNA 片断 2 琼脂糖凝胶电泳条带的观察 通过观察示踪染料的迁移距离可以判断 DNA 的迁移距离 溴酚蓝染料在琼脂糖凝胶的迁移速率大小与 300 和 4000bp 大小的 双链 DNA 片断相同 当迁移足够距离后 就可以通过 Gelview 染色来观察 DNA 片断 Gelview 是一种荧光染料 它可以在做胶时混入其中在电泳 时进行染色 也可以待电泳完成后将凝胶浸泡在稀释的 Gelview 溶液中进行染 色 但必须将凝胶置于紫外透射仪中才可以对凝胶中的 DNA 或 RNA 进行观察 3 DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应 DNA 分子在高 于等电点的 pH 溶液环境中带负电荷 在电场中向正极移动 由于磷酸骨架在 结构上的重复性质 相同数量的双链 DNA 几乎具有等量的净电荷 因此它们能 以相同的速度向正极移动 在一定的电场强度下 DNA 分子的迁移速度取决于 分子筛效应 即 DNA 分子本身的构型和大小 具有不同分子质量或者不同构型 的 DNA 分子泳动速率不一样 可以进行分离 未切割的质粒 DNA 在其泳道上 也许会出现几个条带 之所以这样是由于质粒 DNA 在琼脂糖凝胶中的迁移距离 是由其分子构象及其碱基对大小所决定的 4 质粒 DNA 以下列三种主要构象中的任何一种形式存在 超螺旋 DNA 尽管质粒通常以开环的形式进行描述 然而在细菌细胞内 DNA 链即是盘绕在组蛋白周围形成一种致密的结构 这就是所谓超螺旋结构 由于其结构致密 它在凝胶中的泳动速度最快 线性 DNA 当 DNA 损伤在 DNA 双链相对应的两条链上同时产生切口时 就会出现线性质粒 DNA 这种 DNA 的泳动速率介于超螺旋与切口质粒 DNA 之 间 开环 DNA 在质粒 DNA 复制过程中 拓扑异构酶 I 会在 DNA 双螺旋中的一 条链中引入一个切口 解开质粒的超螺旋 在质粒分离过程中由于物理剪切和 酶的切割作用同样也会在超螺旋质粒中引入切口从而产生松散的开环结构 这 种形式的质粒迁移速率最慢 其 松散 的分子形式阻碍了它在琼脂糖凝胶中 的运动 三 实验步骤 1 取有机玻璃制胶板槽 有透明胶带沿胶槽四周封严 并滴加少量的胶液封好 胶带与胶槽之间的缝隙 2 水平放置胶槽 在一端插好梳子 在槽内缓慢倒入已冷至 60 左右的胶液 使之形成均匀水平的胶面 3 待胶凝固后 小心拔起梳子 撕下透明胶带 使加样孔端置阴极段放进电 泳槽内 4 在槽内加入 0 5 TBE 电泳缓冲液 至液面覆盖过胶面 5 把待检测的样品 按以下量在洁净载玻片上小心混匀 用移液枪加至凝胶的 加样孔中 6 接通电泳仪和电泳槽 并接通电源 调节稳压输出 电压最高不超过 5V cm 开始电泳 点样端放阴极端 根据经验调节电压使分带清晰 7 观察溴酚兰的带 蓝色 的移动 当其移动至距胶板前沿约 1cm 处 可停 止电泳 8 染色 把胶槽取出 小心滑出胶块 水平放置于一张保鲜膜或其他支持物上 放进 EB 溶液中进行染色 完全浸泡约 30min 9 在紫外透视仪的样品台上重新铺上一张保鲜膜 赶去气泡平铺 然后把已染 色的凝胶放在上面 关上样品室外门 打开紫外灯 360nm 或 254nm 通过 观察孔进行观察 实验结果分析实验结果分析 一 质粒电泳结果 质粒 DNA 在含有溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳中被染成橘黄色 如图所示 质 粒 DNA 可以观察到 3 条带 电泳速度最慢的条带显色最浅 质粒 DNA 有 3 种 构型即共价闭合环状质粒 cccDNA 开环质粒 OCDNA 和线状质粒 DNA LDNA 在凝胶电泳中的迁移速度不同 因此电泳后呈 3 条带 超螺旋质粒 DNA 泳动最 快 其次为线状 DNA 最慢的为开环质粒 DNA 本次实验的结果中的三条带 也可推测为超螺旋质粒 DNA 线状 DNA 和开环质粒 DNA 只是由于操作原因 线性 DNA 比较多 二 实验结果讨论分析 1 为获得高纯度的质粒 DNA 必须彻底去除杂蛋白 染色体 DNA 和 RNA 在 整个质粒提取过程中出去染色体 DNA 的关键步骤是加入溶液 溶液 的变性 和复性环节 应控制好变性和复性的时机 加入溶液 时 可剧烈震荡 使菌 体沉淀转变成均匀的菌悬液 此时细胞尚未破裂 染色体不会断裂 加入溶液 时 菌液变粘稠 透明 无菌块残留 加入溶液 时 会立即出现白色沉淀 加入溶液 和溶液 后 应缓慢上下颠倒离心管数次 切忌在旋涡振荡器上剧 烈振荡 否则染色体 DNA 会断裂成小片段 不形成沉淀 而溶解在溶液中 与 质粒 DNA 混合在一起 不利于质粒 DNA 提纯 因此 操作时一定要缓慢柔和 采用上下颠倒的方法 既要使试剂与染色体 DNA 充分作用 又不破坏染色体的 结构 2 酚具有腐蚀性 能损伤皮肤和衣物 使用时应小心 皮肤如不小心沾到 酚 应立即用碱性溶液 肥皂或大量清水冲洗 3 为最大限度去除上清 可在倒掉部分上清后 再将离心管放入离心机稍 作 离心 使残留在管壁的液体集中到离心管底部 再用移液器移除液体 4 注意上样时要小心操作 避免损坏凝胶或将样品槽底部的凝胶刺穿 也 不 要快速按出吸头内的样品 避免挤出的空气将样品冲出样品孔 5 本次实验中 原应灭菌之前加入培养基内的葡萄糖由于操作疏忽而忘记 加 入 随后按照老师指示配制 100mL 10 的葡萄糖溶液一起灭菌 待灭菌后再将 葡萄糖溶液加入培养基中 6 培养菌体所用的 14 个锥形瓶有 2 个锥形瓶中没有菌体生长迹象 另外有 2 个锥形瓶内菌体生长较少 原因可能是接种时操作失误 例如可能是接种环挑 取菌种后离酒精灯火焰太近或者挑取菌种前没有充分冷却 也有可能是接种时 接入的菌量过少等 7 在纯化 DNA 加入冰乙醇的步骤中 2 只离心管在加入的 D