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中文名称 DNA 复制 英文名称 DNA replication 定义 1 从亲代 DNA 合成子代 DNA 的过程 根据沃森 克里克提出的 DNA 双螺旋模型和 DNA 的复制机制 亲代 DNA 的两条链解开 每条链作为新链的模板 从而形成两个子代 DNA 分子 其中每一个子代 DNA 分子包含一条亲代链和一条新合成的链 DNA 复制主要包括引发 延伸 终止三个阶段 引发引发 复制的引发 Priming 阶段包括 DNA 复制起点双链解开 通过转录激活步骤合成 RNA 分子 RNA 引物的 DNA 复制 合成 DNA 聚合酶将第一个脱氧核苷酸加到引物 RNA 的 3 OH 末端复制引发的关键步骤 就是前导链 DNA 的合成 一旦前导链 DNA 的聚合作用开始 滞后链上的 DNA 合成也随 着开始 在所有前导链开始聚合之前有一必需的步骤就是由 RNA 聚合酶 不是引物酶 沿滞 后链模板转录一短的 RNA 分子 在有些 DNA 复制中 如质粒 ColE 该 RNA 分子经过加式成为 DNA 复制的引物 但是 在大部分 DNA 复制中 该 RNA 分子没有引物作用 它的作用似乎只是分开两条 DNA 链 暴露出某些特定序列以便引发体与之结合 在前导链模板 DNA 上开始合成 RNA 引物 这个过程称为转录激活 transcriptional activation 在前导链的复制引发过程中还需要其他一些蛋白质 如大肠杆菌的 dnaA 蛋白 这两 种蛋白质可以和复制起点处 DNA 上高度保守的 4 个 9bp 长的序列结合 其具体功能尚不 清楚 可能是这些蛋白质与 DNA 复制起点结合后能促进 DNA 聚合酶 复合体的七种蛋白 质在复制起点处装配成有功能的全酶 DNA 复制开始时 DNA 螺旋酶首先在复制起点处将双链 DNA 解开 通过转录激活合 成的 RNA 分子也起分离两条 DNA 链的作用 然后单链 DNA 结合蛋白质结合在被解开的 链上 由复制因子 X n 蛋白 复制因子 Y n 蛋白 n 蛋白 i 蛋白 dnaB 蛋白和 dnaC 蛋 白等 6 种蛋白质组成的引发前体 preprimosome 在单链 DNA 结合蛋白的作用下与单链 DNA 结合生成中间物 这是一种前引发过程 引发前体进一步与引物酶 primase 组装成 引发体 primosome 引发体可以在单链 DNA 上移动 在 dnaB 亚基的作用下识别 DNA 复制起点位置 首先在前导链上由引物酶催化合成一段 RNA 引物 然后 引发体在滞后链上沿 5 3 方向不停的移动 这是一种相对移动 也可能是滞后链模板在移动 见后 在一定距离上 反复合成 RNA 引物供 DNA 聚合酶 合成冈崎片段使用 引发体中许多蛋白因子的功能尚 不清楚 但是 这些成份必须协同工作才能使引发体在滞后链上移动 识别合适的引物合 成位置 并将核苷酸在引发位置上聚合成 RNA 引物 由于引发体在滞后链模板上的移动 方向与其合成引物的方向相反 所以在滞后链上所合成的 RNA 引物非常短 一般只有 3 5 个核苷酸长 而且 在同一种生物体细胞中这些引物都具有相似的序列 表明引物酶要在 DNA 滞后链模板上比较特定的位置 序列 上才能合成 RNA 引物 为什么需要有 RNA 引物来引发 DNA 复制呢 这可能尽量减少 DNA 复制起始处的突变 有关 DNA 复制开始处的几个核苷酸最容易出现差错 因此 用 RNA 引物即使出现差错 最后也要被 DNA 聚合酶 切除 提高了 DNA 复制的准确性 RNA 引物形成后 由 DNA 聚合酶 催化将第一个脱氧核苷酸按碱基互补原则加在 RNA 引物 3 OH 端而进入 DNA 链 的延伸阶段 过程过程 DNA 双螺旋的解旋 DNA 在复制时 其双链首先解开 形成复制叉 而复制叉的形成则是由多种蛋白质及 酶参与的较复杂的复制过程 1 单链 DNA 结合蛋白 single stranded DNA binding protein ssbDNA 蛋白 ssbDNA 蛋白是较牢固的结合在单链 DNA 上的蛋白质 原核生物 ssbDNA 蛋白与 DNA 结合时表现出协同效应 若第 1 个 ssbDNA 蛋白结合 到 DNA 上去能力为 1 第 2 个的结合能力可高达 103 真核生物细胞中的 ssbDNA 蛋白与单链 DNA 结合时则不表现上述效应 ssbDNA 蛋 白的作用是保证解旋酶解开的单链在复制完成前能保持单链结构 它以四聚体的形式存在 于复制叉处 待单链复制后才脱下来 重新循环 所以 ssbDNA 蛋白只保持单链的存在 不起解旋作用 2 DNA 解链酶 DNA helicase DNA 解链酶能通过水解 ATP 获得能量以解开双链 DNA 这种解链酶分解 ATP 的活 性依赖于单链 DNA 的存在 如果双链 DNA 中有单链末端或切口 则 DNA 解链酶可以首 先结合在这一部分 然后逐步向双链方向移动 复制时 大部分 DNA 解旋酶可沿滞后模 板的 5 3 方向并随着复制叉的前进而移动 只有个别解旋酶 Rep 蛋白 是沿着 3 5 方向移动的 故推测 Rep 蛋白和特定 DNA 解链酶是分别在 DNA 的两条母链上协同作 用以解开双链 DNA 3 DNA 解链过程 DNA 在复制前不仅是双螺旋而且处于超螺旋状态 而超螺旋状态的存在是解链前的必 须结构状态 参与解链的除解链酶外还有一些特定蛋白质 如大肠杆菌中的 Dna 蛋白等 一旦 DNA 局部双链解开 就必须有 ssbDNA 蛋白以稳定解开的单链 保证此局部不会恢 复成双链 两条单链 DNA 复制的引发过程有所差异 但是不论是前导链还是后随链 都 需要一段 RNA 引物用于开始子链 DNA 的合成 因此前导链与后随链的差别在于前者从复 制起始点开始按 5 3 持续的合成下去 不形成冈崎片段 后者则随着复制叉的出现 不 断合成长约 2 3kb 的冈崎片段 冈崎片段与半不连续复制冈崎片段与半不连续复制 因 DNA 的两条链是反向平行的 故在复制叉附近解开的 DNA 链 一条是 5 3 方 向 另一条是 3 5 方向 两个模板极性不同 所有已知 DNA 聚合酶合成方向均是 5 3 方向 不是 3 5 方向 因而无法解释 DNA 的两条链同时进行复制的问题 为解释 DNA 两条链各自模板合成子链等速复制现象 日本学者冈崎 Okazaki 等人提出了 DNA 的半连续复制 semidiscontinuous replication 模型 1968 年冈崎用 3H 脱氧胸苷短时间 标记大肠杆菌 提取 DNA 变性后用超离心方法得到了许多 3H 标记的 被后人称作冈崎 片段的 DNA 延长标记时间后 冈崎片段可转变为成熟 DNA 链 因此这些片段必然是复 制过程中的中间产物 另一个实验也证明 DNA 复制过程中首先合成较小的片段 即用 DNA 连接酶温度敏感突变株进行试验 在连接酶不起作用的温度下 便有大量小 DNA 片 段积累 表明 DNA 复制过程中至少有一条链首先合成较短的片段 然后再由连接酶链成 大分子 DNA 一般说 原核生物的冈崎片段比真核生物的长 深入研究还证明 前导链的 连续复制和滞后链的不连续复制在生物界具有普遍性 故称为 DNA 双螺旋的半不连续复 制 端粒和端粒酶端粒和端粒酶 1941 年美籍印度人麦克林托克 Mc Clintock 就提出了端粒 telomere 的假说 认为 染色体末端必然存在一种特殊结构 端粒 现在已知染色体端粒的作用至少有二 保 护染色体末端免受损伤 使染色体保持稳定 与核纤层相连 使染色体得以定位 弄清楚 DNA 复制过程之后 20 世纪 70 年代科学家对 DNA 复制时新链 5 端的 RNA 引物被切除后 空缺是如何被填补的提出了质疑 如不填补岂不是 DNA 每复制一次就短 一点 以后随链复制为例 当 RNA 引物被切除后 冈崎片段之间是由 DNA 聚合酶 I 催化 合成的 DNA 填补之 然后再由 DNA 连接酶将它们连接成一条完整的链 但是 DNA 聚合 酶 I 催化合成 DNA 时 需要自由 3 OH 作为引物 最后余下子链的 5 无法填补 于是染 色体就短了一点 在正常体细胞中普遍存在着染色体酶复制一次端粒就短一次的现象 人们推测 可能 一旦端粒缩短到某一阈限长度一下时 他们就会发出一个警报 指令细胞进入衰老 或许 是当细胞判断出它们的染色体已变得太短了 于是分裂也就停止了 造成正常体细胞寿命 有一定界限 但是在癌细胞中染色体端粒却一直维持在一定长度上 这是为什么 这是因 为 DNA 复制后 把染色体末端短缺部分补上需要端粒酶 这是一种含有 RNA 的酶 它 既解决了模板 又解决了引物的问题 在生殖细胞和 85 癌细胞中都测出了端粒酶具有活 性 但是在正常体细胞中却无活性 20 世纪 90 年代中期 Blackburn 首次在原生动物中 克隆出端粒酶基因 端粒酶在癌细胞中具有活性 它不仅使癌细胞可以不断分裂增生 而且它为癌变前的 细胞或已经是癌性的细胞提供了时间 以积累附加的突变 即等于增加它们复制 侵入和 最终转移的能力 同时人们也由此萌生了开发以端粒为靶的药物 即通过抑制癌细胞中端 粒酶活性而达到治疗癌症的目的 至于真核细胞 DNA 末端的结构特点 早就在 1978 年 Blackburn 就以原生动物四膜出 一种纤毛虫 为例说明之 迥纹形式的发夹环 仅由 C A 组成的简单序列大量重 复 C4A2 20 70 链上有许多缺口 nicks 编辑本段 DNA 链的延伸链的延伸 DNA 新生链的合成由 DNA 聚合酶 所催化 然而 DNA 必须由螺旋酶在复制叉处边 移动边解开双链 这样就产生了一种拓扑学上的问题 由于 DNA 的解链 在 DNA 双链区势 必产生正超螺旋 在环状 DNA 中更为明显 当达到一定程度后就会造成复制叉难再继续 前进 从而终 DNA 复制 止 DNA 复制 但是 在细胞内 DNA 复制不会因出现拓扑学问题而停止 有两种机制可以 防止这种现象发生 1 DNA 在生物细胞中本身就是超螺旋 当 DNA 解链而产生正超螺旋时 可以被原来存在的负超螺旋所中和 2 DNA 拓扑异构酶 要以打开一条链 使正超螺旋状 态转变成松弛状态 而 DNA 拓扑异构酶 旋转酶 可以在 DNA 解链前方不停地继续将负 超螺旋引入双链 DNA 这两种机制保证了无论是环状 DNA 还是开环 DNA 的复制顺利的 解链 再由 DNA 聚合酶 合成新的 DNA 链 前已述及 DNA 生长链的延伸主要由 DNA 聚 合酶催化 该酶是由 7 种蛋白质 多肽 组成的聚合体 称为全酶 全酶中所有亚基对完成 DNA 复制都是必需的 亚基具有聚合功能和 5 3 外切酶活性 亚基具有 3 5 外切酶 活性 另外 全酶中还有 ATP 分子它是 DNA 聚合酶 催化第一个脱氧核糖核苷酸连接在 RNA 引物上所必需的 其他亚基的功能尚不清楚 在 DNA 复制叉处要能由两套 DNA 聚合酶 在同一时间分别进行复制 DNA 前导链和 滞后链 如果滞后链模板环绕 DNA 聚合酶 全酶 并通过 DNA 聚合酶 然后再折向与 未解链的双链 DNA 在同一方向上 则滞后链的合成可以和前导链的合成在同一方向上进 行 这样 当 DNA 聚合酶 沿着滞后链模板移动时 由特异的引物酶催化合成的 RNA 引 物即可以由 DNA 聚合酶 所延伸 当合成的 DNA 链到达前一次合成的冈崎片段的位置时 滞后链模板及刚合成的冈崎片断便从 DNA 聚合酶 上释放出来 这时 由于复制叉继续 向前运动 便产生了又一段单链的滞后链模板 它重新环绕 DNA 聚合酶 全酶 并通过 DNA 聚合酶 开始合成新的滞后链冈崎片段 通过这样的机制 前导链的合成不会超过滞 后链太多 最后只有一个冈崎片段的长度 而且 这样引发体在 DNA 链上和 DNA 聚合酶 以同一速度移动 按上述 DNA 复制的机制 在复制叉附近 形成了以两套 DNA 聚合酶 全酶分子 引 发体和螺旋构成的类似核糖体大小的复合体 称为 DNA 复制体 replisome 复制体在 DNA 前导链模板和滞后链模板上移动时便合成了连续的 DNA 前导链和由许多冈崎片段组 成的滞后链 在 DNA 合成延伸过程中主要是 DNA 聚合酶 的作用 当冈崎片段形成后 DNA 聚合酶 通过其 5 3 外切酶活性切除冈崎片段上的 RNA 引物 同时 利用后一个 冈崎片段作为引物由 5 3 合成 DNA 最后两个冈崎片段由 DNA 连接酶将其接起来 形 成完整的 DNA 滞后链 编辑本段 终止终止 过去认为 DNA 一旦复制开始 就会将该 DNA 分子全部复制完毕 DNA 复制 才终止其 DNA 复制 但最近的实验表明 在 DNA 上也存在着复制终止位点 DNA 复制 将在复制终止位点处终止 并不一定等全部 DNA 合成完毕 但目前对复制终止位点的结 构和功能了解甚少在 DNA 复制终止阶段令人困惑的一个问题是 线性 DNA 分子两端是如 何完成其复制的 已知 DNA 复制都要有 RNA 引物参与 当 RNA 引物被切除后 中间所遗 留的间隙由 DNA 聚合 所填充 但是 在线性分子的两端以 5 3 为模板的滞后链的合成 其末端的 RNA 引物被切除后是无法被 DNA 聚合酶所填充的 在研究 T7DNA 复制时 这个问题部分地得到了解决 T7DNA 两端的 DNA 序列区有 160bp 长的序列完全相同 而且 在 T7DNA 复制时 产生的子代 DNA 分子不是一个单位 T7DNA 长度 而是许多单位长度的 T7DNA 首尾连接在一起 T7DNA 两个子代 DNA 分子 都会有一个 3 端单链尾巴 两个子代 DNA 的 3 端尾巴以互补结合形成两个单位 T7DNA 的 线性连接 然后由 DNA 聚合酶 填充和 DNA 连接酶连接后 继续复制便形成四个单位长 度的 T7DNA 分子 这样复制下去 便可形成多个单位长度的 T7DNA 分子 这样的 T7DNA 分子可以被特异的内切酶切开 用 DNA 聚合酶填充与亲代 DNA 完全一样的双链 T7DNA 分子 在研究痘病毒复制时 发现了线性 DNA 分子完成末端复制的第二种方式 痘病毒 DNA 在两端都形成发夹环状结构 DNA 复制 DNA 复制时 在线性分子中间的一个复制起点开始 双向进行 将发夹环状结构变成双链 环状 DNA 然后 在发夹的中央将不同 DNA 链切开 使 DNA 分子变性 双链分开 这 样 在每个分子两端形成一个单链尾端要以自我互补 形成完整的发夹结构 与亲代 DNA 分子一样 在真核生物染色体线性 DNA 分子复制时 尚不清楚末端的复制过程是怎样进 行的 也可能像痘病毒那样形成发夹结构而进行复制 但最近的实验表明 真核生物染色 体末端 DNA 复制是由一种特殊的酶将一个新的末端 DNA 序列加在刚刚完成复制的 DNA 末端 这种机制首先在四膜虫中发现 该生物细胞的线性 DNA 分子末端有 30 70 拷贝的 5 TTGGGG3 序列 该细胞中存在一种酶可以将 TTGGGG 序列加在事先已存在的单键 DNA 末端的 TTGGGG 序列上 这样有较长的末端单链 DNA 可以被引物酶重新引发或 其他的酶蛋白引发而合成 RNA 引物 并由 DNA 聚合酶将其变成双链 DNA 这样就可以 避免其 DNA 随着复制的不断进行而逐渐变短 在环状 DNA 的复制的末端终止阶段则不存在上述问题 环状 DNA 复制到最后 由 DNA 拓扑异构酶 切开双链 DNA 将两个 DNA 分子分开成为两个完整的与亲代 DNA 分 子一样的子代 DNA DNA 复制的