乙肝定量检测的临床应用

乙肝定量检测的临床价值,让疗效看得见，增强乙肝治疗信心,乙肝定量检测的临床价值,乙肝定量检测的临床应用乙肝检测面临的挑战和应对HBsAg / Anti-HBs同时阳性的解读,-让疗效看得见，增强治疗信心,亚洲是乙肝病毒肆虐的重灾区，全球2/3以上的慢性乙肝患者生活在亚洲。而根据1992年全国乙肝血清流行病学调查的结果，中国的乙肝病毒携带者近1.3亿人，平均每10个人中有一个，感染率更高达57.6%。,慢性乙型肝炎的治疗药物,慢性乙肝治疗总体目标,最大限度地长期抑制或消除HBV，减轻肝细胞炎症坏死及肝纤维化，延缓和阻止疾病进展，减少和防止肝脏失代偿、肝硬化、HCC及其并发症的发生，从而改善生活质量和延长存活时间。,Therapeutic endpoints over time,3,1,2,HBsAg转阴或血清转换,HBeAg转阴或血清转换,HBV DNA下降,HBsAg(-),HBsAg 抗-HBs HBeAg 抗-HBe 抗-HBc 结 果 分 析 HBV感染或无症状携带 大三阳，急性或慢性乙肝 小三阳，趋于恢复 乙肝恢复期 有免疫力,HBV检测结果的临床分析,为了更好地提高乙肝疗效，慢乙肝治疗过程中需要多指标进行疗效监测，尤其HBeAg和HBsAg等量化指标。,HBeAg定量监测更能有效预测远期的HBeAg转换率HBsAg定量监测更有效指导HBeAg转换的发生根据HBeAg和HBsAg定量制定个体化治疗策略可显著提高疗效HBeAg定量和HBsAg定量可指导临床用药HBsAb定量检测用于评价疫苗接种后监测,乙肝定量检测的临床价值,一、HBeAg 定量检测的临床应用,乙肝治疗期间，24周HBeAg水平可指导HBeAg血清转换的发生定量HBeAg检测是指导乙肝治疗后发生HBeAg血清转换的有用指标。,ITT人群: n=814,拉米夫定 100 mg qd,派罗欣 180 g qw + 拉米夫定 100 mg qd,派罗欣 180 g qw + 安慰剂 qd,0,24,48,随访24周,72,周,随机化,EOT48周,EOF72周,派罗欣对于HBeAg阳性CHB的研究,PEG IFN -2a单药治疗24周HBeAg定量的指导价值,所有患者(n=263),52%(n=137),21%(n=54),27%(n=72),72周时HBeAg血清转换,24周时HBeAg (PEIU/ml),52%(71/137),20%(11/54),100,100 IU/mL: NPV 96%HBV DNA 9 log: NPV 86%,第24周HBeAg 比 HBV DNA能更好地指导远期HBeAg血清转换率,二、HBsAg定量监测的临床意义,血清HBsAg 水平与肝内乙肝病毒cccDNA有很好的相关性，定量测定HBsAg滴度代表了肝内病毒数量。血清HBsAg含量水平预示乙肝患者所处疾病状态HBsAg定量水平可以指导干扰素的治疗应答，预测抗病毒治疗的疗效及预后。HBsAg定量检测有望成为慢性HBV感染者进行干扰素治疗过程中，监测病毒复制的简单有效、经济的方法评估拉米夫定治疗的应答情况，有助于早期发现耐药突变,HBsAg & CCC-DNA,CCC-DNA-HBV复制最特异的指标之一，是HBV前基因组RNA转录产物最原始的模板，HBV持续复制并感染的关键因素.,Relationship between HBsAg serum levels (by the Laurell test) and intrahepatic cccDNA amounts (median values 0.07, 0.3 and 1.8cccDNA copies/cell),Differences between groups were highly significant by Mann-Whitney test,Werle-Lapostolle et al Gastro 2004; Volz et al, Gastro 2007,Intrahepatic cccDNA is a marker of infected cell: recent reports show a correlation between cccDNA levels and HBsAg serum levels,定量测定HBsAg滴度代表了肝内病毒数量,血清HBsAg 水平与肝内HBV cccDNA有较好的相关性，定量测定HBsAg滴度代表了肝内病毒数量。血清HBsAg水平与肝内HBV-DNA水平也有显著相关,A,B,Chan et al. Clin Gastro Hepatol 2007,A,血清HBsAg含量水平预示乙肝患者所处疾病状态,Rodella et al. J Clin Virol 2006,10,000,1000,10,0.1,Acute,Convalescent,HBeAg+CHB,HBeAg-CHB,HBsAg log10 IU/mL,派罗欣治疗24周HBsAg定量的指导价值,32%,52%,16%,停药1年后的HBeAg转换,24周HBsAg (IU/mL),20,000,1,500,1,500-20,000,19%(8/43),Lau et al. APASL 2009 Poster 083,在24周时 HBsAg 48周),派罗欣 180 g/周,联合治疗(48周),派罗欣延长疗程治疗HBeAg阳性乙肝的研究,Wu et al. APASL 2008,派罗欣180g qw,治疗48周,49例中国HBeAg阳性乙肝患者,延长治疗72-96周,18例HBeAg转换的患者继续治疗监测HBsAg定量情况,31例HBeAg未转换的患者继续治疗监测HBeAg定量情况,延长治疗72-96周,延长疗程可提高HBeAg和HBsAg清除率,累积HBeAg消失率(%),派罗欣治疗周,18%,30%,35%,0,15,45,60,37%,30,Wu. APASL 2008,12,51%,24,36,48,72,53%,96,96周累积HBsAg清除率=27 (13/49),48周累积HBsAg清除率=10 (5/49),延长治疗使HBeAg保持在低水平,0,100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000,1100,基线,12周,24周,48周,72周,延长治疗组 72周治疗(n=16),48 周治疗 (n=15),定量HBeAg水平(PEIU/mL),Jiang et al. 2009 EASL poster,延长治疗使HBsAg进一步下降,0,40,80,120,160,200,240,280,基线,12周,24周,48周,72周,延长治疗组 72周治疗(n=16),48 周治疗 (n=15),定量HBsAg水平(IU/mL),Jiang et al. 2009 EASL poster,可见：HBsAg定量检测可预测 抗病毒治疗的疗效及预后。,CHB患者经过抗病毒治疗，HBsAg下降速度和幅度不同。HBsAg水平下降速度快、幅度大预示其治疗效果好。治疗结束时HBsAg水平越低，停药后随访的HBsAg清除率越高，患者预后越好。,HBsAg定量检测的临床应用-用来监测经干扰素治疗患者的HBV复制情况,HBsAg定量检测有望成为慢性HBV感染者进行干扰素治疗过程中，监测病毒复制的简单有效、经济的方法。,Antiviral Res. 1994 Apr;23(3-4):251-7.,HBsAg定量检测的临床应用-评估拉米夫定治疗的应答情况，有助于早期发现耐药突变。,Kohmoto et al. Journal of Medical Virology 75:235239 (2005),HBsAg定量作为临床监测指标的重要性 专家共识,HBsAg的消失是CHB患者可能达到的最佳治疗效果HBsAg的血清转换是CHB患者达到的最佳治疗效果完全免疫应答应定义为持续的HBsAg消失HBsAg的显著降低预示病人预后良好通过HBsAg定量检测可以预测那些患者最可能发生免疫应答，并指导治疗方案的制定,三、表面抗体定量检测， 用于评价疫苗接种后监测,表面抗体(anti-HBs) 监控具有重要意义10被视为阳性,但是100才具备保护意义,定量检测HBsAb指示免疫应答,HBsAb (IU/l) 接种的要求100007年后,提供准确可靠的疫苗接种前和接种后的保护性抗体量化指标,国际标准 阳性10U/l； 通常认为 100 U/l 才具备保护能力。,乙肝定量检测的临床价值,乙肝定量检测的临床应用乙肝检测面临的挑战和应对HBsAg / Anti-HBs同时阳性的解读,-让疗效看得见，增强治疗信心,在中国：HBsAg携带者超过1.2亿！慢性乙肝患者约3000万！每年报告乙肝新发病例数约50万！ 传统乙肝2对半检测都是ELISA方法完成，只能定性判定阴阳性。两对半最先进的检测技术是全自动化学发光技术，可以实现定量检测，更好辅助乙肝诊断与治疗中的疗效追踪。,乙型肝炎检测现状,低浓度HBsAg的准确检测对于临床确诊和流行病学监控具有重要意义,血清HBsAg是诊断HBV感染的直接证据所谓“HBsAg阴性”的HBV感染者中，有相当一部分为血清HBsAg呈低水平而被漏检的假阴性对于输血安全、院感控制具有重要意义对于流行病学、病原学研究具有重要意义,8089例非肝炎病区住院患者血清 共检出HBsAg阳性 816 例（10.09%) HBsAg浓度在5ng/mL以下的有189例， 占总数的2.34%，占HBsAg阳性人群的23.16%,1 ng/mL以下的有84例(44.40%) 12ng/mL的有33例(17.5%) 25ng/mL的有72例(38.10%),低浓度HBsAg不容忽视,1ng/mL以下者： 占总数的1.04% 占HBsAg阳性人群的10.3%,0.5ng/mL以下者占HBsAg阳性人群的约5%,陈瑜等，中华检验医学杂志，2001，第3期 楼滨等，中华临床感染病杂志，2009，第3期,但，HBsAg测定中可能存在的挑战： 假阴性,HBsAg含量低于所用方法的测定下限之下。比如ELISA、试纸条等 如感染的“窗口期”、急性期后或恢复期、自限性感染末期的携带者等编码HBsAg的HBV S基因的突变HCV/HDV重叠感染对HBV复制和/或HBsAg的表达的抑制作用测定方法所用抗体对HBV不同基因型检测敏感性的不同,突变原因：自发突变（HBV聚合酶链反应的高出错率）选择性压力下的突变治疗抑制（拉米夫定）疫苗接种/高效价免疫球蛋白的应用疫苗的广泛应用，促使HBV 发生变异的免疫压力逐渐增大，变异的机会增加。,突变的重要原因,99,121,124,107,137,138,139,147,149,G,D,E,D,164,R,E,145,144,F,Y,158,s-s-,s-s-,-s-s-,-s-s-,M,I,195,S,W,M,I,196,198,210,Loop 1 of a determinant,Loop 2 of a determinant,(Carman, W. J Viral Hepatitis 1997 4: 11-20, modified),疫苗逃逸突变株: T126S T131N M133L K141E D144E G145R,126,141,131,133,诊断逃逸突变株: P120T/A/QD144A T131KG145R,抗病毒耐药突变株 I195MW196S M198I,120,基因变异所致HBsAg假阴性的最大问题,医学安全性尤其是逃逸突变株流行较广的地区，在HBV高流行区域，突变株的流行率也高 导致疫苗免疫的失败 要在进行人群HBV分子流行病学的基础上，研制针对主要流行HBsAg变异株的乙肝疫苗，保证免疫的有效性。临床检测中“两对半”异常模式的出现,最常见的HBsAg突变位点,对于ELISA检测， 变异株的检出能力面临挑战,变异株的检出能力与试剂的设计模式有关,检测模式 假阴性风险 （捕捉抗体/信号抗体） 单克隆/单克隆 单克隆/多克隆 双单克隆/多克隆,威高全自动微粒子化学发光法乙肝试剂通过使用多克隆抗体和多种单克隆抗体夹心法来提高变异株的检出能力，降低假阴性风险。,化学发光法检测乙肝获得极高灵敏度，有效避免低浓度HBsAg漏检,2010年版慢性乙型肝炎防治指南中明确指出：对于因其他疾病而接受化疗、免疫抑制剂治疗的患者，应常规筛查HBsAg；若为阳性，即使HBV DNA阴性和ALT正常，也应在治疗前1周开始服用拉米夫定或其他核苷(酸)类似物。对HBsAg阴性、抗HBc阳性患者，在给予长期或大剂量免疫抑制剂或细胞毒药物（特别是针对B或T淋巴细胞单克隆抗体）治疗时，应密切监测HBV DNA和HBsAg，若出现阳转则应及时加用抗病毒治疗。,HBsAg定量检测试剂的特征,方法学: 微粒子化学发光免疫分析技术(CMIA)高灵敏度高灵敏度 0.05 IU/ml(大约 0.2ng/ml)高特异性: 99.87%标准品溯源性: W.H.O 国际标准(80/549)，具有WHO标准的定量检测试剂,临床特异性越高，假阳性率越低。在多个医院临床评估中对5892个标本的检测中， HBsAg显示出优异的99.94% 的临床特异性,1：HBsAg高灵敏度与高特异性的完美结合,“全自动化学发光定量检测HBsAg完美结合了高灵敏度（100）与高特异性（100），尽管这两者的判断标准是相互对立的。”,NPV：阴性预测值PPV：阳性预测值,1： HBsAg高灵敏度与高特异性的完美结合,和市场主流同类产品测试结果相比，全自动化学发光法测试结果具有更优异的特异性和灵敏度。,Assay I1: 进口试剂AAssay I2: 进口试剂BAssay A1: 酶促发光试剂Assay A2: 酶免试剂AAssay A3: 酶免试剂B,1：HBsAg高灵敏度与高特异性的完美结合,高灵敏度可用于感染的早期检测,临床灵敏度即阳性检出率；临床灵敏度越高，假阴性率越低。相比于同类产品检测结果，全自动化学发光检测乙肝具有更优异的灵敏度,COI: Cut Off IndexAssay A1:酶免定性试剂,1：HBsAg高灵敏度与高特异性的完美结合,高灵敏度可用于感染的早期检测,全自动化学发光定量检测HBsAg相对 酶免定性试剂显示出更优异的血清转化灵敏度，能更早地检测出被感染的病人。威高内部实验结果。,1：全自动化学发光法定量检测HBsAg 高灵敏度与高特异性的完美结合,（1）优异的血清转化灵敏度 保证感染的早期诊断（2）高度的特异性 赢得最佳治疗时间,2：威高全自动化学发光 检测乙肝病毒突变的能力,HBsAg 抗原决定簇发生的突变可导致试剂漏检。HBsAg “a”决定簇上最主要的突变：（*Weber B. Expert Rev Mol Diagn 2005, 5: 75-91.）氨基酸的替换 ：G145R, K141E, T131I122和123之间的插入,Subtype alleles:亚型等位基因aa insertion:氨基酸插入aa substitutions associated with immune escape: 与免疫漏检相关的氨基酸替换,威高全自动化学发光HBsAg 能检测出所有的7个突变标本，而 Assay 1, 2 和 3 都有部分样本漏检,威高全自动化学发光检测HBsAg突变样本,威高全自动化学发光法能检测乙肝突变样品，然而有些厂家的试剂则不能检测123、143位点的突变。不同的HBsAg免疫检测方法对检测不同HBsAg突变的能力及灵敏度不同。威高全自动化学发光法具有更全面的检测能力,灵敏地识别病毒变异,2：威高全自动化学发光 检测乙肝病毒突变的能力,3：全自动化学发光定量检测HBsAb 用于监测免疫应答的疗效,从低浓度高浓度均具有极高的精密度,提供准确可靠的疫苗接种前和接种后的保护性抗体量化指标,第一,第二,第三次接种后HBsAb与进口试剂检测结果的对比,10000,1000,100,10,1,0,0,1,10,100,1000,10000,Vaccinated persons (n = 113),WEGO Anti-HBs IU/L,Test B IU/L,n = 0,n = 109,n = 4,n = 0,具有非常好的相关性,威高全自动化学发光定量检测HBsAb疫苗接种后检测结果同雅培AxSym比较,高临床特异性和出色的辨别能力降低复测率。确保临床结果的准确性,在1354例献血者样本中，临床特异性达到99.8%。应用特殊的DTT还原剂进行预处理，消除了由于IgA或IgM相关分子引起的非特异反应。,4：Anti-HBc高特异性降低复测率，确保临床准确性,乙肝定量检测的临床价值,乙肝定量检测的临床应用乙肝检测面临的挑战和应对HBsAg / Anti-HBs同时阳性的解读,-让疗效看得见，增强治疗信心,HBV感染后血液中指标的出现,HBsAg / Anti-HBs同时出现的探讨,这个发现从上个世纪70年代就有相关研究在不停的探讨。最早检测肝炎血清学标记物使用RIA技术， 这种技术较ELISA要敏感些。进入80年代，更多的客户使用ELISA方法,检出几率少些。90年代后， 随着化学发光新技术的出现，研究和探讨产生机制和意义一直在进行。,病人处于HBV感染的恢复期，病 人体内存在HBsAg-Anti-HBs的免疫复合物两种HBV亚型感染，一种亚型已经产生抗体，另外一种还没有（HBsAg Ad/ Anti-HBs Ay),存在HBV的突变,常见于：1、 新生儿母婴感染2、 肝移植的患者 IFN治疗出现 HBsAb 血清转换,因 S 基因变异,而未能清除 HBsAg；疫苗接种，