荧光分光光度计使用

工作原理工作原理 荧光产生的原理 荧光的定义 某些物质受紫外光或可见光照射激发后能发射出比激发光波长较长的光 荧光产生的原理 化学物质能从外界吸收并储存能量 如光能 化学能等 而进入激发 态 当其从激发态再回复到基态时 过剩的能量可以电磁辐射的形式放射 即发光 荧光化合物的两种特征光谱 1 荧光激发光谱 就是通过测量荧光体的发光通量随波长变化而获得的光谱 它反 映了不同波长激发光引起荧光的相对效率 2 荧光发射光谱 如使激发光的波长和强度保持不变 而让荧光物质所产生 的荧光 通过发射单色器后照射于检测器上 扫描发射单色器并检测各种波长下相应的荧光强度 然后通过记录仪记录荧光强度对发射波长的关系曲线 所得到的谱图称为荧光光谱 物质的激发光谱和荧光发射光谱 可以用作该物质的定性分析 当激发光强度 波长 所用溶剂及温度等条件固定时 物质在一定浓度范围内 其发射光强度与溶液中该物质的 浓度成正比关系 可以用作定量分析 荧光分析法的灵敏度一般较紫外分光光度法或比色法为高 浓度太大的溶液会有 自 熄灭 作用 以及由于在液面附近溶液会吸收激发光 使发射光强度下降 导致发射光强度 与浓度不成正比 故荧光分析法应在低浓度溶液中进行 荧光发射的特点 可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光 而一旦停止 供能 发光 荧光 现象也随之在瞬间内消失 溶液荧光光谱通常具有的特征 1 斯托克斯位移 在溶液荧光光谱中 所观察到的荧光的波长总是大于激发光的波 长 2 荧光发射光谱的形状与激发波长无关 3 荧光发射光谱的形成与吸收光谱的形状有镜像关系 荧光的猝灭 荧光分子的辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会减弱甚至猝灭 这是由于激发态分子的电子不能回复到基态 所吸收的能量无法以荧光的形式发射 一 些化合物有天然的荧光猝灭作用而被用作猝灭剂 以消除不需用的荧光 因此荧光物质的 保存应注意避免光 特别是紫外光 的直接照射和与其他化合物的接触 荧光效率 荧光分子不会将全部吸收的光能都转变成荧光 总或多或少地以其他形式 释放 荧光效率是指荧光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率 与发射荧光光量子的数 值成正比 荧光效率 发射荧光的光量分子数 荧光强度 吸收光的光量子数 激发光强度 发射荧光的光量子数亦即荧光强度 除受激发光强度影响外 也与激发光的波长有关 各个荧光分子有其特定的吸收光谱和发射光谱 荧光光谱 即在某一特定波长处有最大吸 收峰和最大发射峰 选择激发光波长量接近于荧光分子的最大吸收峰波长 且测定光波量 接近于最大发射光波峰时 得到的荧光强度也最大 测量原理测量原理 稀溶液 IF 2 303 FI0 c b 其中 I0 为激发光强度 If 为荧光强度 f 为荧光效率 b 为液池厚度 和 c 分别为发光物质的摩尔吸光系数和摩尔浓度 技术指标 技术指标 波长扫描范围 220 900nm 波长精度 1 5nm 狭缝范围 0 15 20nm 信噪比 S N 比 150 以上 水拉曼峰测定 狭缝 5nm 最高扫描速度 5 500nm min 操作规程操作规程 1 开机 a 确认所测试样液体或固体 选择相应的附件 b 先开启仪器主机电源 预热半小时后启动电脑程序 RF 530XPC 仪器自检通过后 即可正常使用 2 测样 1 spectrum 模式 a 在 Acquire Mode 中选择 Spectrum 模式 对于做荧光光谱的样品 Configure 中 Parameters 的参数设置如下 Spectrum Type 中选择 Emission 给定 EX 波长 给定 EM 的扫描范围 最大范围 220nm 900nm 设定扫描速度 扫描间隔 狭缝宽度 点击 OK 完成参数的设定 对于做激发光谱的样品 Configure 中 Parameters 的参数设置如下 Spectrum Type 中选择 Excitation 给定 EM 波长 给定 EX 的扫描范围 最大范围 220nm 900nm 设定扫描速度 扫描间隔 狭缝宽度 点击 OK 完成参数的设定 b 在样品池中放入待测的溶液 点击 Start 即可开始扫描 c 扫描结束后 系统提示保存文件 可在 Presentation 中选择 Graf Radar Both Axes Ctrl R 来调整显示结果范围 在 Manipulate 中选择 Peak Pick 来标出峰位 最后在 Channel 中进行通道设定 d 述操作步骤对固体样品同样适用 2 Quantitative 模式 a 在 Acquire Mode 中选择 Quantitative 模式 b Configure 中 Parameters 的参数设置如下 Method 选择 Multi Point Working Curve Order of Curve 中选择 1st 和 No 给 定 EX EM 波长 设定狭缝宽度 点击 OK 完成参数的设定 c 在样品池中放入装有空白溶液的比色皿后执行 Auto Zero 命令校零点 d 点击 Standard 模式 制作工作曲线 e 将样品池中的空白溶液换成一系列的已知浓度的样品标准溶液进行测量 执行 Read 命令 得到相应的荧光强度 系统根据测量值自动生成一条 荧光强度 浓度 曲线 f 在 Presentation 中选择 Display Equation 得到标准方程 将此工作曲线 Save 为扩展名为 std 的文件 g 工作曲线制备完毕 即可进入未知样的测量 选择进入 Unknown 模式 将样品池 中的已知浓度标准溶液换成待测样品溶液 执行 Read 命令 即可得到相应的荧光强度和 相应的浓度 将此 Save 为扩展名为 qnt 的文件 3 Time Course 模式 a 在 Acquire Mode 中选择 Time Course 模式 b Configure 中 Parameters 的参数设置如下 给定 EX EM 波长 设定狭缝宽度 设定反应时间 读取速度 读取点数 点击 OK 完成参数的设定 c 在样品池中放入装有空白溶液的比色皿后执行 Auto Zero 命令校零点 d 将样品池中的空白溶液换成待测溶液 点击 Start 即可开始扫描 扫描结束后 即可得到荧光强度对时间的工作曲线 e 将此工作曲线 Save 为扩展名为 TMC 的文件 3 关机 退出软件后关毕主机 注意事项注意事项 a 请注意爱护液体比色皿 特别是测试有机样品的同学请在测量完毕后用有机溶剂 清洗 干燥后再放入盒子中 否则会造成比色皿表面严重污染 影响透光度 b 固体样品池仅剩一个 测试完毕请物归原处 测试完毕请注意登记 关闭仪器 分子吸收 荧光 磷光辐射跃迁分子吸收 荧光 磷光辐射跃迁 无辐射跃迁无辐射跃迁 去活化过程去活化过程 处于激发态分子不稳定 通过辐射或非辐射跃迁等去活化过程返回至基态 这些过 程包括 1 振动弛豫 在液相或压力足够高的气相中 处于激发态的分子因碰撞将能量以热的形式传递给周 围的分子 从而从高振动能层失活至低振动能层的过程 称为振动弛豫 2 内转换 对于具有相同多重度的分子 若较高电子能级的低振动能层与较低电子能级的高振动 能层相重叠时 则电子可在重叠的能层之间通过振动耦合产生无辐射跃迁 如 S2 S1 T2 T1 定性分析定性分析 任何荧光都具有两种特征光谱 激发光谱与发射光谱 它们是荧光定性分析的基础 1 激发光谱 改变激发波长 测量在最强荧光发射波长处的强度变化 以激发波长对荧光强度作图 可得到激发光谱 激发光谱形状与吸收光谱形状完全相似 经校正后二者完全相同 这是因为分子吸收 光能的过程就是分子的激发过程 激发光谱可用于鉴别荧光物质 在定量时 用于选择最适宜的激发波长 2 发射光谱 发射光