《实验二沉淀反应》PPT课件

实验二沉淀反应 一 实验内容 1 双向琼脂扩散试验 小组做 2 单向琼脂扩散试验 示教 3 免疫电泳 示教 4 火箭电泳 示教 5 尿液HCG检测 胶体金免疫法 小组操作 免疫标记技术 沉淀反应 6 录像 免疫反击战 二 目的与要求 1 掌握单扩 双扩基本原理 方法 结果分析及应用 2 熟悉免疫电泳基本原理及应用 3 了解火箭电泳基本原理及方法 4 认识示教单扩 火箭电泳和免疫电泳的染色片的图形 5 了解胶体金免疫法检测HCG的原理 方法 三 讲解内容 一 沉淀反应的定义 指可溶性Ag与相应Ab在一定条件下发生特异性结合 出现肉眼可见的沉淀物的反应 可溶性Ag 沉淀原 相应Ab 沉淀素 沉淀反应与凝集反应的比较 抗原性质反应物稀释对象不同凝集反应颗粒性抗原凝集物稀释Ab 振摇后不浑浊 试管凝集 沉淀反应可溶性抗原沉淀物稀释Ag 振摇后浑浊 二 沉淀反应的类型 根据Ag和Ab扩散的介质不同分为两大类 1 在溶液中进行扩散 环状沉淀试验 2 在琼脂中进行扩散 琼脂扩散试验 单扩 双扩 火箭电泳 免疫电泳等 1 环状沉淀试验 介绍 用途 用于法医学鉴定和昆虫嗜血性鉴定 2 双向琼脂扩散试验 原理 琼脂凝胶是一种半固体胶状物 里面有无数小孔 Ag Ab在孔中进行扩散 在比例适合处形成沉淀线 即为阳性反应 双孔型 Ag Ab分子质量分析 三角型 Ag性质分析 梅花孔型 Ag Ab效价的滴定 双向琼脂扩散试验用途 抗原或抗体的检测 定性或可粗略定量 缺点 需时长 灵敏度不高 3 单向琼脂扩散试验 示教 用途 已知抗体测抗原 定量实验 缺点 耗时长 1 10 1 20 1 40 1 80 Ag稀释度 4 免疫电泳 示教 先Ag电泳 后扩散 注意 1 2孔为Ag样本孔 免疫电泳的用途 A 用于某种蛋白缺乏的疾病的诊断 B 用于抗原纯度的定性分析 5 火箭电泳 示教 用途 已知抗体测抗原 定量实验 火箭电泳 单向琼脂扩散 电场 优点 耗时短 反应敏感性好 四 操作内容1 甲胎蛋白 AFP 的检测 小组操作 1 材料 A 待测Ag AFP可疑血清 B 阳性对照 AFP阳性血清 C 阴性对照 生理盐水 NS D 已知抗体 兔抗人AFP 2 方法及步骤 A 琼脂反应板制备 B 打孔 C 加样 D 反应 湿盒37 24h E 结果分析 已知Ag 已知Ab 阴性对照 1 32与1 16相吻合1 16与1 8相吻合1 8与AFP 相吻合 标本中抗原为AFP抗原 1 32有沉淀线1 64无沉淀线 标本中抗原滴度为1 32 E 结果分析 5 注意事项 A 打孔不要划破边缘 B 加样不宜过多 不要溢出 C 反应时间为24h D 合理分配吸管 Ag Ab吸管不能混淆 2 胶体金免疫法检测尿液HCG 人绒毛膜促性腺激素 humanchorionicgonadotropin HCG 受精卵移行到子宫内着床后 形成胚胎 在胚胎的发育过程中 胎盘合体滋养层细胞产生大量的HCG 是一种具有促性腺发育的糖蛋白类激素 可通过孕妇血液循环而排泄到尿中 HCG作为抗原 可以用已知特异性抗体检测尿液中的HCG以诊断早孕 胶体金免疫法实验原理 胶体金是由氯化金与还原剂反应形成的一种胶体颗粒 具有吸附蛋白质的特性 可以标记Ag或Ab 胶体金颗粒聚集到一定大小后即呈现出红色 早早孕HCG胶体金试纸 采用了双抗体夹心法的检测模式 1 鼠抗人HCG单抗 固定的检测线 2 羊抗鼠IgG 固定的质控线 尿中HCG与金标记的鼠抗人HCG结合形成免疫复合物 随层析作用向上移动 至检测线与鼠抗人HCG抗体结合而聚集显色 HCG金标试纸 带条中含有均匀分布的胶体金标记的鼠抗人HCG单抗 在检测线未结合的金标记鼠抗人HCG单抗 IgG 随着尿液上行 到达质控线与羊抗鼠IgG 二抗 结合而显色 作为质控对照 标志线 带条中含有均匀的胶体金标记的鼠抗人HCG单抗 1 鼠抗人HCG单抗 2 羊抗鼠IgG 二抗 胶体金免疫法与放射免疫测定法 ELISA等方法相比 具有的优点 1 胶体金法不需ELISA法中所要求的作用的底物和显色剂 操作更简便 2 胶体金法无污染 不危害操作者 也不污染环境 3 胶体金标记抗体在冻干状态下室温储存较稳定 有效期长 4 灵敏度高 10 25IU L 完成实验报