酶复习题-答案.doc

酶复习题1. 名词解释：不可逆性抑制，底物抑制，别构抑制剂，酶的自杀性底物，酶的激活剂，酶偶联的定法，2. 酶的提取典型的抽提液由哪些组分组成？3. 酶的提取及纯化的注意事项。4. 列举至少五种酶的纯化方法。5. 酶的纯度指标鉴定。6. 什么是对照实验？简述其类型及方法。7. 酶纯化过程中实验记录的项目。8. 酶纯化过程中的注意事项。9. 酶的分子量测定方法。10. 酶活力测定方法类型及特点。11. 写出米-曼式方程式并简述Km的意义。12. 何为酶促反应初速率？反应时间、酶的浓度、底物浓度及反应的平衡常数与初速率有何关系？13. 简述双分子反应的类型及机制特点。14. 简述可逆性抑制的动力学特点。15. 如何设计实验检验抑制类型是否可逆？16. 列举基因工程中重要的工具酶及其作用。1名词解释：不可逆性抑制，不可逆性抑制作用（修饰抑制）：抑制剂与酶的必需基团共价结合，引起酶活性丧失，抑制剂不能用超滤、透析、凝胶过滤等方法除去。底物抑制:一分子底物与酶的一个位点结合，另一底物与酶的另一位点结合,往往出现死端复合物，对酶产生抑制作用。过量的底物可视为反竞争性抑制作用。别构抑制剂：抑制剂与酶活性中心外的部位结合，通过改变酶的空间构象，从而影响酶与底物的结合，或影响酶的催化效率。这种抑制剂称为别位抑制剂（allosteric inhibitors），别构抑制剂，或变构抑制剂。酶的自杀性底物：Kcat型不可逆抑制剂又称酶的自杀性底物，也是底物的类似物，酶的自杀性抑制剂可以作为酶的底物与酶活性中心相结合，生成酶-底物复合物，并接受酶的催化作用。然而，经催化后的中间产物不游离出产物，而是转化为酶的抑制剂，进一步与酶活性中心共价结合，对酶产生抑制作用。自杀底物都有其自身的作用对象，专一性很高酶的激活剂：是指能提高酶促反应速率的物质，此物质不是酶和酶的底物。其中通过与酶分子结合来提高酶促反应速率的激活剂称为酶的激活剂（enzyme activator）。 酶偶联的定法：是利用酶作为分析试剂，对一些酶的活性和一些化合物（底物浓度、激活剂、抑制剂、酶的辅助因子、嘌呤、核苷酸等）进行定量分析的一种方法。1 酶的提取典型的抽提液由哪些组分组成？抽提液的选择l 典型的抽提液由以下七方面组分组成（可根据需要予以取舍）：抽提液包括：l 离子强度调节剂：KCl、NaCl、蔗糖(细胞内的离子强度=0.3mol/L)l pH缓冲液：各种缓冲液l 温度效应剂：甘油、二甲亚砜l 蛋白酶抑制剂： 苯甲磺酰氯（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)、二异丙基氟磷酸（异氟磷， diisopropyll fluorophosphate，DIFP)l 抗氧化剂：二硫苏糖醇（dithiothreitol DTT）、b-巯基乙醇(2-mercapto- ethanol b-ME)l 重金属络合剂：EDTA、柠檬酸l 增溶剂：TritonX-100、脱氧胆酸盐2. 酶的提取及纯化的注意事项。建立一个可靠和快速的酶活性测定方法1 在纯化过程中需要大量时间检测不同纯化阶段的酶活性。所以要求检测方法快速、简捷、灵敏、专一和准确。快速比准确更重要。2.酶环境：酶不仅是催化剂，而且也是活细胞中代谢机制的组成成分，试管中的环境与细胞内的环境是大不相同的，不能忽视这一差别可能对酶行为的影响。纯化过程可在很多方面影响酶的活性。如辅因子的去除、细胞结构成分（如脂膜）的去除等。如b-羟丁酸脱氢酶反应需要加入脂类。3.控制温度和时间：整个纯化过程均应在0C的条件下进行，且时间不宜过长，最好在2-3天内完成；4.在纯化酶的过程中常加入一些酶的保护剂，如二硫苏糖醇或b-巯基 乙醇等保护巯基酶；5.避免酸、碱。酶溶液的pH不要低于5和高于9。加酸碱时要防止局部浓度升高；6.防止表面变性。转移、搅拌、加固体盐时应防止气泡。7.有机溶剂应预冷后加入，防止酶的变性和产生溶解热。同时防止局部浓度过高；7.有机溶剂应预冷后加入，防止酶的变性和产生溶解热。同时防止局部浓度过高；8.去垢剂有时虽可有助于酶的溶解，但有时难免发生酶变性；9.酶的保存：冻融不失活的酶可以在低温冰箱中保存数月；在高盐浓度稳定的酶可以悬浮于饱和硫酸铵中；真空冷冻干燥的酶粉易溶解并可在室温下保存；酶在提取和纯化的过程中不怕霉菌污染，但在保存过程中应予以预防。3. 列举至少五种酶的纯化方法。调节酶溶解度的方法：改变离子强度 盐溶和盐析 分级沉淀法反抽提法；改变PH和温度；改变介电常数；根据酶分子大小、形状不同的分离方法 离心分离 凝胶过滤 透析和超滤；根据酶分子电荷性质的方法 ：离子交换柱层析 电泳 等电聚焦；根据酶分子专一性结合的方法：亲和层析 免疫吸附层析 染料配体亲和层析 共价层析 4. 酶的纯度指标鉴定。5. 什么是对照实验？简述其类型及方法。样品对照1）样品中含有少量与待测产物相同的物质；2）样品中含有内源性底物,以产生相同的产物；3）样品中含有旁反应，可使一些内源性物质产生相同的产物。方法：对照管的反应液中不加底物。底物对照方法：对照管的反应液中不加底物。方法：对照管中不加待测的样品。 时间对照：如果反应混合液中即含有酶制剂的不纯（含有产生相同产物的其他条件），又有底物自发分解的可能性，可采用时间对照予以消除。方法：反应混合物中含有样品和底物，但反应时间为 0 时的测定值为对照值。可以在加入底物前加入蛋白变性剂或反应抑制剂，也可在加入样品前加入蛋白变性剂。6. 酶纯化过程中实验记录的项目及注意事项。纯化过程的记录猪肝异柠檬酸脱氢酶的提纯过程过程：记录：提取总量 酶活性 总活性 蛋白含量 比活性 得率 纯度匀浆 氯仿抽提37.5%-55%硫酸铵组分（透析）DEAE纤维素洗脱液磷酸钙吸附洗脱液凝胶过滤，异柠檬酸洗脱酶的分子量测定方法:1分析超离心法 2 凝胶过滤法3SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳酶活力测定方法类型及特点。（一）定时法：测定反应开始后某一段时间（t1t2）内，产物（或底物）的变化量来求取反应的初速率。此法又称两点法。但t1常采用反应开始的时间，即t1= 0。此法需要在t2时终止反应。（二）连续监测法连续监测法又称动力学法或速率法。该法连续测定（每15秒1分钟间隔监测一次）酶促反应过程中底物或产物浓度随时间的变化，从其直线部分求出反应的初速率。（三）平衡法平衡法又称终点法，测定反应达到平衡时底物或产物的总变化量，再计算酶的活力。此法无需以时间来计算反应速率，只是待测标本与正常标本在相同条件下反应，以比较待测标本是否正常。7. 写出米-曼式方程式并简述Km的意义。Km的意义Km是酶的特性常数。当pH、温度、离子强度不变的条件下，酶的Km值不因反应中酶的浓度变化而改变。即Km只与酶的性质有关，而与酶的浓度无关。Km值是反应速率为最大速率一半时的底物浓度。Km已知时，可求得任一底物浓度时酶活性中心被底物饱和的分数当k3很小时，Km = k2/k1，Km Ks 代表酶对底物的亲和力。Km大则亲和力小。已知Km和细胞内底物的浓度，则可知该酶在细胞内是否受此底物调节。对于可逆反应，可根据对正逆两向底物Km值的不同，推测正逆反应的效率，以了解酶的主要催化方向和生理意义。对于代谢过程中的连续反应由不同的酶催化时， Km值和相应的底物浓度可以帮助了解代谢的限速步骤。一种酶催化多种底物时，从Km值可以了解天然底物，成为酶命名的依据。8. 何为酶促反应初速率？ 酶促反应刚刚开始时，没有影响反应的任何因素存在时的反应速率称为酶促反应的初速率（initial velocity）。9. 反应时间、酶的浓度、底物浓度及反应的平衡常数与初速率有何关系 Vmax S v = S + Km10. 简述双分子反应的类型及机制特点。双底物的酶促反应动力学机制总结反应动力学机制序列反应乒乓反应有序反应随机反应底物的结合和产物的释放顺序产物不能在底物完全结合前释放第一个产物的释放发生于第二个底物的结合之前反应过程是否有三元复合物生成是否反应过程是否有修饰酶生成否是是否有领先底物是否是产物是否有序生成是否是底物和产物的竞争关系A与Q竞争A与Q竞争B与P竞争A与Q竞争B与P竞争动力学图的特征一组相交于一点的直线一组平行直线11. 简述可逆性抑制的动力学特点。 可逆性抑制作用：抑制剂与酶的必需基团非共价结合而引起酶的活性降低或消失，用物理的方法可将抑制剂除去。结合方式有两种。竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制抑制剂与底物结构的相似性相似不相似抑制剂在酶上的结合部位与底物相同与底物不同底物与抑制剂是否有竞争关系有无是否可通过增加底物浓度解除抑制作用是否抑制剂是否可结合酶与底物复合物否是抑制剂是否可结合游离的酶是否Km增大不变减小Vmax不变减小减小12. 如何设计实验检验抑制类型是否可逆？13. 列举基因工程中重要的工具酶及其作用。限制性内切酶作用：与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰 系统，限制外源DNA，保护自身DNA。 DNA连接酶: 补粘性末端和平端DNA分子之间的连接DNA连接酶的用途（1） 两个双链DNA片段连接起来（2） 修补带有缺口的双链DNA分子逆转录酶或者反转录酶（reverse transcriptase）是以mRNA为模板合成互补DNA即cDNA，用于组建cDNA基因文库 T多核苷酸激酶（T4 polynucleotide kinase)能催化ATP的-磷酸转移到DNA或RNA的5端羟基上。 用于：放射性磷标记DNA链的5-末端, 使缺少5-端磷酸的DNA磷酸化，用于连接反应 碱性磷酸酶简称AKP，此酶能特异的切除DNA或RNA 5-端的磷酸产