【毕业学位论文】（Word原稿）PTD-Cry1Ac载体的构建表达及杀虫活性研究-农业昆虫与害虫防治硕士论文

密级： 论文编号： 硕士学位论文 体的构建表达及杀虫活性研究 of of I 摘 要 苏云金芽孢杆菌（ 目前世界上用途最广、产量最大的微生物杀虫剂，在世界范围内得到广泛的应用。 编码 虫蛋白的基因也作为最主要的杀虫基因转入到了多种重要的粮棉作物中，在害虫防治中起着巨大的作用。 但目前转基因 作物和 剂的使用正面临着致命的威胁，即害虫对 抗药性。 素合理、有效的应用引起了全世界的关注和讨论。蛋白转导结构域（ 一类能自动穿透细胞膜，并能作为载体将其它生物大分子携带进入细胞膜内的一段富含精氨酸的多肽。 近年来 医学上的应用研究得到了空前的发展 , 其转导特性已成功地应用于多种疾病的临床 治疗研究。 本研究通 过 虫蛋白 合表达载体的构建、融合蛋白的表达纯化、生物活性测定和免疫检测，证明了 强了 虫蛋白 杀虫活性。 主要结果如下： 1. 按 照 6 6顺序，合成 6 个组氨酸、 11 个氨基酸功设计构建了适合原核表达的四种 合表达载体，即 体（含有 能片段基因，简称 P）、 体（含有 +能片段基因，简称 T） 、 体（含有 分 能片段基因，简称 、 和 体（含有 +部分 能片段基因，简称 。 经测序分析，与实验设计完全一致，表明获得相应融合表达载体。 2. 对构建的融合表达载体进行诱导、表达 。 在 20 ， 116 荡培养 26 h， 度为 0.1 件下进行诱导，使表达的蛋白在上清大大多于沉淀， 得到可溶性融合蛋白。 这为纯化提供了极大的便利条件。 3. 融合表达 蛋白 以小菜蛾室内种群和上海田间种群进行生物测定。生测 实验结果如下：对小菜蛾室内种群，加 的融合蛋白 T） 的 g/ P）蛋白 g/效倍数为 ；同样，加 的融合蛋白 g/ 蛋白 g/增效倍数为 。对小菜蛾上海田间种群，加 的融合蛋白 的 g/蛋白 g/效倍数为 ，表 明 素 4. 四种融合蛋白进行 纯化。 纯化的蛋白与 两个 小菜蛾室内种群的 进行 疫检测，结果表明：在 加入 T 和 白分别比加入 P 和 白的吸光值要大，说明 T 和 白分别比 P 和 白与小菜蛾 合性要强。同时也说明了 ，可能与 项目将 用于农业研究领域，并证实了 生物杀虫剂具有增效作 。开辟了 用的新领域并为克服害虫抗药性提出了新途径。 关键词： 小菜蛾，苏云金芽孢杆菌， 性，蛋白转导结构域（ he Bt)of of to a of of Bt Bt to an in to is a to of t is t is a of to or In in TD in in In to TD CP t. TD c. as 1. of AT 1 ; ; Q; Q. by 2. We by by 0 ， 116 6 h .1 It to 3. of of of as of )AT g/) g/Q)AT g/Q) g/ Q)AT g/Q) g/ . of TD of TD t, as as to t a to by TD in t), V 目 录 第一章 文献综述 . 1 t 毒素的研究进展 1 t 毒素的分类 1 t 毒素的结构 2 t 毒素的杀虫机理及其分子机制 3 虫对 素的抗性 7 虫对 素抗性的研究进展 7 虫对 素的抗性机制 8 抗性相关的 素的主要受体 8 体的变化与昆虫对 素的抗性 11 白转导结构域 研究进展 14 发现及转导机制 15 合分子的研究 16 用概述 17 研究的目的意义 17 第二章 材料与方法 . 19 料 19 试昆虫 19 株和质粒 19 养基 19 、试剂和主要缓冲液 19 器设备 22 法 23 体构建 23 合基因在大肠杆菌 的诱导表达 27 取 27 凝胶电泳检测 28 达蛋白的免疫检测 28 合蛋白纯化 30 合蛋白的生物测定 31 第三章 结果与分析 . 32 合表达载体构建 32 能基因的 增 33 能基因片段的亚克隆 35 体的酶切回收 36 达载体的酶切鉴定 37 酸序列检测 37 合蛋白的表达纯化 39 融合蛋白的诱导表达 39 合表达蛋白的 定 41 合表达蛋白的纯化 42 合表达蛋白的 疫杂交鉴定 45 合表达蛋白的活性测定 46 化蛋白与小菜蛾中肠 免疫检测 47 菜蛾中肠 提取 47 化蛋白与小菜蛾中肠 免疫检测 47 第四章 结论与讨论 . 49 论 49 论 50 参考文献 . 52 致 谢 . 58 作 者 简 历 . 59 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 氨基肽酶 N 食膜刷状囊泡 血清白蛋白 云金芽孢杆菌 二胺四乙酸 基化磷脂酰肌醇 虫晶体蛋白 道尔顿 白转导结构域 偏二氟乙烯 二烷基硫酸钠 ,N,N,N,N, 中 国 农 业 科 学 院 硕 士 学 位 论 文 第 一 章 文 献 综 述 1 第一章 文献综述 t 毒素的研究进展 苏云金芽孢杆菌 （ 是一种分布极其广泛的革兰氏阳性细菌。 1911 年德国地中海粉螟 分离到一种致病杆菌，这种杆菌在 1915 年被定名为苏云金芽孢杆菌。 （ 1953）发现在苏云金芽孢杆菌的休眠期内，在形成芽孢的同时，能产生蛋白性质的伴孢晶体（ （ 1954）研究表明 伴孢晶体蛋白有杀虫作用。随着对苏云金芽孢杆菌研究的不断深入，已经确定其对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目等多种昆虫，以及线虫、螨类和原生动物都具有特异性的杀虫活性。 自发现苏云金芽孢杆菌近 100 年来，因其对害虫高效、对人畜安全、对环境友好而在世界范围内得到广泛的应用。 目前世界上用途最广、产量最大的微生物杀虫剂，占微生物杀虫剂总量的 95 %以上，编码 虫蛋白的基因也被转入到了多种重要的粮棉作物中 ， 2004 年统计表明全世界种植的转 因农作物面积已达 2240 万公顷（ et 2005）。 在减少害虫危害、增加作物产量、减少化学农药对环境的污染等方面发挥了重要作用（ et 2003; 2003）。 t 毒素的分类 自 1981 年 库斯塔克亚种 株中克隆了第一个编码 来（ 1981），人们对晶体蛋白的研究取得了重大进展，每年都有大量新的 基因被分离克隆。 1989 年 据 将 为两类：一类是具有溶血溶细胞作用的 27 体蛋白 一类是只有杀虫活性的晶体蛋白 是主要的一类。根据 虫晶体蛋白菌株来源不同和对不同昆虫毒力的差异 ，将 虫晶体蛋白 划分为四种： 鳞翅目昆虫、 鳞翅目和双翅目昆虫、 鞘翅目昆虫、双翅目昆虫分别有特异的杀虫活性（ 1989）。 1995 年 在无脊椎动物 病理学年会（ 首次提出，并于 1998 年发表了一种新的 虫晶体蛋白分类方法，根据氨基酸序列同源性进行分类，而与杀虫晶体蛋白的生物活性无关，从而形成了一个开放式的、日趋完善的分类系统：同源性在 45 %以下，为第一等级，用阿拉伯数字表示；同源性在 45 % 78 %之间，为第二等级，用大写英文字母表示；同源性在 78 % 95 %之间，为第三等级，用小写字母表示；同源性在 95 %以上，为第四等级，用阿拉伯数字表示。只要满足来自苏云金芽孢杆菌的伴胞晶体，对目标昆虫具有毒性，和与已知的 白具有同源性，就可纳入这一分类系统。 中 国 农 业 科 学 院 硕 士 学 位 论 文 第 一 章 文 献 综 述 2 目前，已经发现 299 种杀虫晶体蛋白基因，分属于 44 群（ 因 42 群， 因 2 群）， 136种 模式基因。 t 毒素的结构 目前研究最多的是 晶体蛋白，由 1100 1200 个氨基酸组成，分子量为 130 140 体蛋白的 N 端差异较大，同源性只有 40 % 90 %，而 C 端具有高度的保守性，同源性大于 90 %。这两部分具有不同的结构和功能特性，前者为疏水性部分，由 5 个保守 区段组成，形成 晶体蛋白维持毒力和作用专一 性所必需的功能区域；后者为亲水性部分，为 要用于维持伴胞晶体的形成 （ 1990） 。 目前 ， 1995)、 1991） 晶体蛋白的毒性多肽通过 图 1， 而且结构非常相似，都 是 由三个 位于活性 由 7个两亲性的 1-7），其中 5螺旋位于 的中心位置，共同形成一个 螺旋束； 中间，由三个反向平行的 扑结构，即所谓的 由两组弯曲的反向平行的 构。 图 1毒性多肽的三维结构 of 析 白的一级结构氨基酸序列的同源性，表明 白存在 5 个保守区（ 1993 ）， (如图 1 包含 的 5 螺旋。 5 螺旋的中心位置可能与维持 含有 的 7 螺旋和 I 的第一个 中 国 农 业 科 学 院 硕 士 学 位 论 文 第 一 章 文 献 综 述 3 两个二级结构组成了这两个 间的连结区。 是跨于 I 和的一个 含有 中的一个 含有肽链的 C 端，包埋于 的 1998; 邵宗泽 , 2000)。 图 1白氨基酸序列的保守区 1 素的杀虫机理及其分子机制 目前 素的杀虫机理尚不确定，一般认为 解活化、与受体结合、插入和孔洞或离子通道形成等五个环节（图 1作用模式 为 ：（ a）晶体蛋白被靶标昆虫取食后，在昆虫中肠内溶解为前毒素；（ b）前毒素经中肠蛋白酶水解活化，释放出毒性多肽；（ c）毒性多肽与中肠上皮细胞刷状缘膜（ 的特异受体结合；（ d）毒性多肽构象 改变， 进一步插入膜内；（ e）插入的毒性多肽使中肠膜形成孔洞或离子通道，引起离子渗漏，渗透平衡遭到破坏，水随之进入中肠细胞，导致细胞膨胀解体，最终导致昆虫死亡。同时，人们又利用蛋白质及脂膜相互作用的生物化学原理，通过结构比较和功能分析，试图阐明 素杀虫机理的分子机制。 中 国 农 业 科 学 院 硕 士 学 位 论 文 第 一 章 文 献 综 述 4 图 1蛋白杀虫机理示意图 t t 毒素的溶解 体蛋白的溶解性可影响其作用的专 一性，是决定晶体蛋白毒力的因素之一，它取决于晶体蛋白的组成及其与昆虫中肠内环境的相互作用。 体蛋白（ 入昆虫中肠后，必须经过溶解才能进一步发挥毒性作用，主要是其肽链间的二硫键和分子间的盐键断裂。 （ 1983） 研究表明晶体蛋白可以溶解于 2 或 加有巯基试剂的碱性溶液中，所以昆虫中肠内环境诸如 、还原电势、去垢性、体积等都可能影响晶体蛋白在昆虫体内的溶解性(et 1993)。鳞翅目幼虫的中肠 一般都较高，呈碱性，对晶体蛋白的溶解很有利 。伴孢晶体蛋白毒力的差异可能因晶体蛋白的组成和昆虫中肠的溶解条件不同所致。 t 毒素的酶解活化 昆虫中肠内含有多种蛋白酶，溶解的晶体蛋白还需在中肠蛋白酶的作用下经历一系列酶的剪切活化过程才能发挥毒性，与酶解活化过程相关的蛋白酶主要是类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶（ 1990）。溶解的晶体蛋白由 130 右的前毒素，释放出 0 右的抗酶毒性多肽， 毒素蛋白在 8 位的精氨酸后被切断（ 1998），在 ，其最后活化 的毒性多肽的 23 位的赖氨酸（ 1989; 1989）。在对鲇泽亚种 系的毒素晶体蛋白进行活化时发现，以大菜粉蝶 虫的中肠提取液活化，毒素既能杀死大菜粉蝶幼虫，也能杀死埃及伊蚊 虫；以埃及伊蚊幼虫的中肠提取液活化，则只对埃及伊蚊有毒（ Z 等， 1989）。因而昆虫中肠酶液的组成直接影响到晶体蛋白的降解活化，对晶体蛋白作用的专一性起着重要作用。 在毒性多肽的 和 I 之间存在三个盐桥（ 1995），这些氨基酸残基都在 内，在毒素蛋白的溶解和激活过程中，能维持蛋白成球形。 中 国 农 业 科 学 院 硕 士 学 位 论 文 第 一 章 文 献 综 述 5 t 毒素与受体的结合 性多肽与柱状细胞刷状缘膜上的受体专一性的结合，这一步是决定 是 素发挥毒杀作用过程中最重要的一步。毒性多肽的可变区趋于极性或带电，有可能暴露出一些亲水性的特殊位点， 毒性多肽以此与中肠上皮刷状缘膜受体的亲水残基相互作用，而形成复合物（ et 1992），引起毒性多肽结构上的某些变化，从而使毒性多肽能够插入 昆虫中肠 细胞膜中，触发细胞膜成孔 (et 1992; et 1998)。 人最早利用碘标记方法测定结合力，他们明确了欧洲粉蝶幼虫中肠的 碘标记毒蛋白有高度亲和性，并证实 烟草天蛾 欧洲粉蝶不同的杀虫谱与结合位点的亲和性相关 (et 1988)。 也发现烟草天蛾和烟芽 夜蛾中肠上皮细胞膜上的特异性受体是决定 同杀虫谱的主要因素，且 毒性与受体蛋白和毒 素蛋白的结合能力呈正相关，膜受体蛋白是毒 素 蛋白专一性的决定因子 (ie et 1990)。 位于昆虫上皮细胞膜上的磷脂筏 (容纳不同类型蛋白质如糖基磷脂肌醇锚着蛋白，十六烷基酰基化和双酰基化膜转移蛋白等的场所，富含蛋固醇、神经鞘脂等物质。研究表明，鳞翅目昆虫的 素 蛋白氨肽酶类受体特异性地位于磷脂筏中，磷脂筏在 蛋白氨肽酶类受体介导的成孔过程是具有重要的作用 (et 2002)。 素 蛋白与昆虫受体间的相互作用关系甚为复杂，一种 素 蛋白在同一种昆虫中可有多种受体，在不同种类的昆虫中其受体可能不同，而不同种类的 素 蛋白也可能共享同一受体。 性多肽（活化的 体蛋白）与受体结合的具体过程包括可逆和不可逆结合两步（ 2000）：首先是毒性多肽的 和 这一步是可逆的；然后是结合在受体上的毒性多肽插入细胞膜中产生离子孔道，这一步是不可逆的。毒性多肽通过 I 中 顶端上 突环的静电吸附及疏水作用，与中肠 的受体蛋白识别并进一步结合。同时， -“三明治”结构也具有多种功能，对毒素的毒性有调节作用，而且， 2002）在对 诱变研究表明 这一结构参与毒素与受体的结合，并可以维持毒素分子三维结构的完整。 t 毒素插入及孔洞或离子通道的形成 入膜内，形成孔洞或离子通道，导致膜完整性的破坏，引起离子渗漏，水随之进入细胞，细胞因膨胀而 解体、死亡。在细胞水平上毒性多肽与敏感昆虫中肠 的受体结合后，很快上皮细胞的液泡增加，然后内质网网状组织 膜间明显扩大，膜间连接被破坏，高尔基体复合体周围出现严重空泡化； 线粒体也是如此，随着线粒体膨胀的同时，线粒体内脊逐渐溶解，导致中肠上皮脱落从而引起细胞膜穿孔（ 1989）。据 1991）报道，两种 素对舞毒蛾 虫的毒力与它 们和刷状缘膜受体的 中 国 农 业 科 学 院 硕 士 学 位 论 文 第 一 章 文 献 综 述 6 亲和力成反比，却与形成孔洞的能力相关。 对于毒性多肽在昆虫中肠 程有两种分子模型，都与 的长的疏水和亲水脂螺旋有关 。一个模型是 1990年 “铅笔刀”模型。他们发现 个 56 的端点，离膜最远，作用于膜时， 疏水的 56螺旋，打开成“铅笔刀”形式插入上皮膜磷脂双分子层中，多个毒素分子的螺旋在膜中聚合而形成孔，毒素其余部分在膜或受体表面。目前这个模型的证据较少。另一个是“ 型，毒性多肽 的 45螺旋与连 接两个螺旋的环（ 成一个疏水的发夹结构，处于 边缘，毒性多肽与受体结合后构象发生变化，使得发夹结构利于插入到细胞膜内，毒素其余部分象伞一样附着于膜上，从而起始孔洞的形成。 1997年 和 与 I 之间引入二硫键限制分子内运动，结果表明：45螺旋的发夹结构插入上皮膜， 的其它部分以“伞状”平铺于膜表面。 1999年 肽酶（ , 结合区，证明是位于 的 135 198就是 45螺旋。 4螺旋的各位点突变对小菜蛾（ 结合的影响，发现 4螺旋带电荷的 菜蛾毒性 最重要的位点。 2000年 的 45螺旋间的 证明 45螺旋与孔洞形成有关。 总之，由于 能扰乱了昆虫正常的渗透平衡、离子梯度、 调节及养分的吸收，最终引起中肠上皮细胞的破坏、死亡（图 1 图 1蛋白杀虫机理 分子机制 示意图 t 中 国 农 业 科 学 院 硕 士 学 位 论 文 第 一 章 文 献 综 述 7 虫对 素的抗性 虫对 素抗性的研究进展 近 30 年来，人类认识和应用 源的速度和范围得以空前发展。特别自 70 年代以来，编码虫蛋白的基因也作为最主要的杀虫基因转入到了多种重要的粮棉作物中（郭三堆， 1995），表达 虫晶体蛋白的转基因作物 在害虫防治中起着巨大的作用， 对农业发展产生深远的影响（ 2002） 。转 花商业化大面积推广以来，转 因的甘蓝（ 蔡林 ,1999）、油菜（ 林良斌 ， 2001） 等转 因蔬菜也相继研究成功，也可以稳定高效地控制蔬菜害虫，而且转因油菜在我国已经处于试验示范阶段（ 官春云 ， 2002） ，大规模种植也将很快成为现实。在 20 世纪 80 年代以前，由于 其伴胞晶体蛋白的种类繁多，作用方式非常多样，人们通常认为昆虫对之产生抗性的可能性很少（ 1998）。不久害虫对