【毕业学位论文】(Word原稿)植病生防菌哈茨木霉(Trichoderma harzianum)的研究-应用微生物

分类号： 单位代码： 10389 密 级： 学 号： 1081711 福建农林大学硕士学位论文 植病 生防菌 哈茨木霉 ( 研究 学 科 门 类：理学 一级学科名称：生物学 二级学科名称：微生物学 研 究 方 向：应用微生物 研 究 生： 指 导 教 师： 完 成 时 间：二 0 一一年四月 s as a on 2011 独创性声明 本人声明，所呈交的学位 (毕业 )论文，是本人在指导教师的指导下独立完成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作了答谢的 地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位 (毕业 )论文作者亲笔签名： 日期： 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位 (毕业 )论文的规定，即学校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅，学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在 年后解密可适用本授权 书。 不保密，本论文属于不保密。 学位 (毕业 )论文作者亲笔签名： 日期： 指导教师亲笔签名： 日期： 福建农林大学硕士学位论文 1 目 录 中文摘要 . 1 . 2 第一章 综 述 . 1 1 哈茨木霉在植物病害防治中的应用 . 1 2 哈茨木霉生防机理的研究进展 . 2 生作用 . 2 争作用和重寄生作用 . 2 导植物对病菌的抗性 . 3 3 哈茨木霉的生物学研究 . 3 养条件 . 3 养条件 . 4 4 哈茨木霉的脂肪酸生态 学 . 4 5 木霉的绿色荧光蛋白标记研究 . 5 色荧光蛋白的研究 . 5 霉的绿色荧光蛋白标记和应用 . 5 6 在微生物群落结构研究中的应用 . 6 7 本论文的研究基础和研究意义 . 7 第二章 哈茨木霉的分离、筛选与鉴定 . 9 引言 . 9 1 材料与方法 . 9 验材料 . 9 验方法 . 9 2 结果与分析 . 10 壤标本中木霉菌的分离 . 10 萎病生防功能木霉菌初步筛选 . 10 霉菌的形态学及 定 . 11 3 讨论 . 12 第三章 哈茨木霉的生物学特性 . 13 引言 . 13 1 材料与方法 . 13 验材料 . 13 验方法 . 13 2 结果与分析 . 15 同营养对哈茨木霉 丝生长和产孢量的影响 . 15 养时间对哈茨木霉 丝生长和产孢的影响 . 20 种量对哈茨木霉 丝生长和产孢的影响 . 21 度对哈茨木霉 丝生长和产孢的影 响 . 21 始 对哈茨木霉 丝生长和产孢的影响 . 22 福建农林大学硕士学位论文 2 茨木霉 适抑菌条件研究 . 22 3 讨论 . 24 第四章 哈茨木霉的脂肪酸生态学特性 . 26 引言 . 26 1 材料与方法 . 26 验材料 . 26 验方法 . 26 2 结果与分析 . 28 茨木霉脂肪酸特征指纹图谱构建 . 28 养条件对哈茨木霉菌脂肪酸的影响 . 29 同处理哈茨木霉脂肪酸生物标记的检测 . 32 同处理间哈茨木霉脂肪酸生物标记的分布特性分析 . 34 同处理脂肪酸生物标记多样性指数比较 . 35 3 讨论 . 37 第五章 哈茨木霉对尖孢镰刀菌的抑制作用 . 38 引言 . 38 1 材料与方法 . 38 验材料 . 38 验方法 . 38 2 结果与分析 . 39 板对峙法测定哈茨木霉 枯萎病病原菌的抑制效果 . 39 菌圈法测定哈茨木霉 枯萎病病原菌的抑制效果 . 40 微镜下观察哈茨木霉 枯萎病病原菌菌丝生长的影响 . 41 3 讨论 . 42 第六章 哈茨木霉的 因转导及转化子生物学特性 . 44 引言 . 44 1 材料与方法 . 44 验材料 . 44 验方法 . 45 2 结果与分析 . 47 茨木霉遗传转化体系的建立 . 47 茨木霉转化子菌株 野生型菌株 生物学性质的比较 . 49 3. 讨论 . 52 第七章 哈茨木霉在不同土壤中的定殖特性 . 54 引言 . 54 1 材料与方法 . 54 验材料 . 54 验方法 . 54 2 结果与分析 . 54 茨木霉转化子 不同类型土壤中的定殖 . 54 茨木霉转化子 有无植株的土壤中定殖随时间变化情况 . 55 3 讨论 . 56 第八章 哈茨木霉对土壤微生物群落结构影响 . 58 引言 . 58 福建农林大学硕士学位论文 3 1 材料与方法 . 58 验材料 . 58 验方法 . 58 2 结果与分析 . 59 不同土壤中脂肪酸标记总量和种类的影响 . 59 不同土壤中的微生物群落的影响 . 60 3 讨论 . 67 第九章 结论与展望 . 69 参考文献 . 70 致 谢 . 76 福建农林大学硕士学位论文 1 中文摘要 本文从台湾地区不同市县的 13 份土壤标本中分离到一株对 镰刀菌 有较强抑制作用的木霉生防菌，经鉴定为哈茨木霉， 命名为 本文 研究了不同碳源、氮源、碳氮比、无机盐以及不同培养条件如培养时间、接 种 量、初始 、温度等 对 丝生长和产孢量的影响， 探讨了 丝生长及产孢与其菌体脂肪酸种类及含量的之间的相关性， 测定了哈茨木霉菌株四株不同寄主的 镰刀菌 的抑制作用， 构建了哈茨木霉的 因遗传转化体系，成功获得了一个 因标记的哈茨木霉菌株，命名为 究了该菌株在不同的土壤类型中的定殖特性及其对土壤微生物群落结构的影响，结果如下： 最佳碳源为葡萄糖、最适氮源为牛肉浸膏 ， 碳氮比以 3:1 为最好， 最适 无机盐 为 硫酸镁 。 经正交优化确定 最适固体培养基组成 合 为 ： 葡萄糖 18 g、 6.6 g、 g、 g、水 1000 最佳培养条件为：培养 3 天最利于菌丝生长， 4 天产孢量最大，接种量以 1%为最好；初始 为 4菌丝生长好， 为 6，产孢 量 最大； 25 为最适菌丝生长温度，最佳产孢温度为 30 。 不同的营养条件能够引起哈茨木霉脂肪酸种类 和含量的改变，但 四种主要脂肪酸的含量均表现为： 6,9c/18:0 9c 。 不同营养条件下的哈茨木霉经聚类分析聚成五个类群，结果表明不同类群的处理之间平均脂肪酸含量、种类、及主要脂肪酸的含量差异与哈茨木霉的菌丝生长及产孢情况具有一定的相关性。 6,9c/18:0 肪酸的含量在菌丝生长和产孢的过程中起重要作用。 哈茨木霉菌株 四株枯萎病病原菌 制率均在 80%间。当镰刀菌孢子浓度为 107 个 /，抑菌圈直径分别为 27.9 代谢液造成了镰刀菌菌丝发生扭曲、 变细、 原生质 体 膨大、浓缩、菌丝内出现大液泡等畸形。 抑菌 作用 主要是通过竞争和抗生作用实现 的 。 通过 导的原生质体法 构建了哈茨木霉的 化体系 ， 成功地将携带潮霉素 B 抗性基因和 记基因的质粒 合到哈茨木霉的染色体上，获得 一株 荧光强度高，遗传稳定的转化 菌株 菌丝生长的生物量和产孢量与野生型相比略有降低， 抑菌 能力略有降低，但抑菌效果仍显著。 采用 因标记的 茨木霉菌株研究了在不同土壤中的定殖特性，结果表明， 哈茨木霉菌株 不同类型的土壤中的定殖情况不同，定殖难易程度依次为沙土 营养土 黄土 菜园土 。木霉定殖的前 15 天，在有植株的情况下定殖数量显著高于无植株的， 16 天后这种优势力逐渐降低， 32 天后趋于稳定，数量约为 105 个 /析结果表明： 够明显地抑制土壤中细菌、真 菌、放线菌 等微生物 的生长，从而改变土壤的微生物群落结构。 关键词 ：哈茨木霉、生物学特性、绿色荧光蛋白、 建农林大学硕士学位论文 2 of 3 in to In on of of as pH on . of . to a . in of on as . . :1, in By . 8 g, 6.6 g, g, g, 000 . pH 25 0 . of be in of 18:2 6,9c/18:0 9c . By . to . to of 18:2 6,9c/18:0 an in of of . 0% 0%. 07 of 27.9 mm . a a T. s FP . we FP a to a to of in to of 5 in no in 05 2 in of 1 第一章 综 述 木霉是一类普遍存在的真菌，常见于土壤中，是土壤微生物的重要群落， 也见于植物残体及动物粪便上，从植物根围 (叶围 (种子、球茎表面经常可以分离到 1。木霉被认为是最有希望的生物防治因子，在植物病害生物防治中扮演着重要角色，生防潜力也日益受到重视 2。据统计，在全世界 25 个国家以及美国 43 个州的有关生物防治课题中，其中大约有 34%是关于木霉的。而木霉属中应用最多的为哈茨木霉 (常用剂型为麦麸制剂 3。目前，已知木霉属的 9 个种中，除了哈茨木霉外，另外常见的还有 4 种具有生防潜力，绿木霉 (康