HIV%2FHBV合并感染者HBV+PreS%2FS区抗原表位变异分析.doc

HIV%2FHBV合并感染者HBV+PreS%2FS区抗原表位变异分析 主堡塞墅塑堕压堑壹堂苤查!芏!旦箜!鲞箜!塑堡!i!塑!垦!P曼!业!垒鲤!型!HIVHBV合并感染者HBV PreSS区抗原表位变异分析聂源廖宝林胡凤玉邓西子兰芸唐小平蔡卫平李凌华高鸣李锋广州医科大学附属广州市第八人民医院研究所，广州510060聂源和廖宝林对本文有同等贡献通信作者李锋，Emailfengliunc163，电摘要】目的分析HIVHBV合并感染者外周血中HBV PreSS区抗原表位变异特征，为研究合并感染致病机制提供实验依据。 方法收集广州市第八人民医院感染病中心xx年1月份至xx年12月份收治慢性HBV感染者的基本信息和实验室检查资料，按治疗前HIV抗体检测结果分为HIVHBV合并感染组、HBV单一感染组，采集患者外周血，提取血清中HBV DNA，采用巢式PCR法扩增HBV DNA的PreSS基因，将获得的PCR产物进行序列测定(直接测序法)后，采用ContigExpress软件进行序列拼接、BioEdit软件进行序列比对，参照相应基因型HBV的标准序列，分析比较HIVHBV合并感染和HBV单一感染两组的HBV PreSS区抗原表位变异。 统计学处理采用x2检验，软件为SPSSl90。 结果成功扩增HBV PreSS基因的患者共150例，其中HIVHBV合并感染者90例，HBV单一感染者60例，两组患者性别、年龄、基因型、HBeAg状态、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)比较无统计学差异；HBV PreSS各表位变异分析结果HIVHBV合并感染组所有的细胞毒性T细胞(CTL细胞)表位变异发生率均偏高，其中Pres2aal一15表位变异发生率比较有统计学意义(x26964，P=0008)；PreS2aal一15表位变异中缺失发生率合并感染组(111)高于HBV单一感染组(33)(x2=2959，P=0085)。 B细胞表位中，Pre-s2aal-26HIVHBV合并感染组的变异发生率显著高于HBV单一感染组，差异有统计学意义(x26924，P=0OlO)，其余B细胞表位在两组间比较无统计学意义(P值均005)；两组间辅助性T细胞(Th细胞)表位变异发生率比较均无统计学意义(P值均005)。 结论合并HIV感染可增加HBV PreSS区CTL细胞表位变异，尤其是Pres2区57端表位变异，提示HBV变异与宿主免疫状态相关，为进一步研究HIVHBV合并感染的致病机制提供了可靠资料。 【关键词】人类免疫缺陷病毒；肝炎病毒，乙型；PreSS基因；抗原表位；变异基金项目“十三五”国家科技重大专项(xxZXl0202203)；国家自然科学基金 (81670536)；广东省自然科学基金(xxA030310108)；广东省科技计划(xxA020215008)DOI103760cmaiissn10039279201902004Analysisofantigen phenotypicepitopes variationinHBV Pre-SSregion in HIVHBV coinfected patientsNieYuan，Liao Baolin，Hu Fengyu，Deng Xizi，Lan Yua，凡增Xiaoping，Cai We咖ing，Li Linghua，GaoMing，Li FengInstituteof GuangzhouEighthPeoples HospitalAffiliatedtoGuangzhou MedicalUniversity，Cuangzhou510060，ChinaNie Yuanand LiaoBaolin arecontributed equallyto thearticleCorresponding authorLiFeng，Email知ngliunc163corn，Tel00862083710937【Abstract】0bjectiveTo analyzethe characteristicmutations ofepitopes inHBV PreSS regioninHIVHBV COinfected patientsperipheral bloodtoprovide basicdata forstudying thepathogenesis ofHIVHBV COinfectionMethods Thechronic hepatitis B infectedpatientsadmittedto theInfectiousDisease Centerof theEighth PeopleS Hospitalof Guangzhoufrom Januaryxxto Decemberxxwereenrolled intoHIVHBV co-infected groupand HBVmono-infected groupaording to the resultof HIVantibodydetection respectivelybefore treatmentHBV DNAinserum wasextracted and PreSS regionof论著万方数据132主堡塞堕塑I堕压丛垂堂苤查!堡!旦箜!鲞箜!塑坠i!垦!P垦!墅!垒趔!盟!HBVDNA wasamplifiedbynestedPCRAftersequencingof theobtained PCRproducts(directsequencing)，ContigExpress softwarewasused forsequencesplicing andBioEdit softwarewasused forsequencealignmentWith referenceto thestandard sequenceof thematched genotypeHBV，mutants ofHBVPreSS regioninHIVHBV coinfected groupand HBVmonoinfected groupwere analyzedrespectivelvStatistical analysiswas performedby chisquare testwith SPSSl90statistiealanalysis softwareResultsHBV PreSS fragmentswere suessfullyamplified froml50patientsincluding90cases of HIVHBV coinfected groupand60cases ofHBV Inono-infected group，with matchedgender，age，genotype，HBeAgstatus，alanine aminotransferase(ALT)，aspartate aminotransferase(AST)The resultof analyzingmutantsof HBV PreSS regionindicated thatthe incidenceof mutationin allepitopes forcytotoxicT cellsfCTLcells)was higherin theHIVHBV coinfected groupandPreS2aal一15epitope wassignificantly higher(X2=6964，P=0008)The incidenceof deletionsin PreS2aal15epitope inHIVHBV coinfeetedgroup(111)was higherthan HBVmonoinfected group(33)(x2=2959，P=0085)In theB cellepitopesthe incidenceof mutations inPre-S2aal26in theHIVHBV coinfected groupwas significantlvhigherthan HBVnlonoinfocted group()(=6924，P=0010)and therewas nostatistical signifieancebetweentwo groupsin otherB cell epitopesNo differencesin helperT cell(Th cell)epitopes werefoundbetween thetwo groupsConclusionsCoinfection withHIV increasedthe CTLcell epitopesmutations intheHBV Pre-SS region，especially the5end epitopemutationsinPreS2regionwhich indicatedthatHBV mutationis relatedtothehost immunestatus，pathogenesis ofHIVHBV co-infection【Key words】Human immunodeficiencyepitopes；M utationandshowed guidinginformation forfurther studyon thevirus；HepatitisB virus；PreSSgene；AntigenFund programNationalMajor Scientificand TechnologicalSpecial Projeetduring the13th FiveyearPlan Period(xxZXl0202203)；National NaturalScience Foundationof China (81670536)；GuangdongNatural ScienceFoundation(xxA030310108)；Guangdong ProvinceScience andTechnology Program(xxA020215008)DOI103760emajissn10039279201902004由于传播途径相似，HIV感染者常合并HBV感染，我国HIV感染人群中合并HBV感染率为42194o。 合并HIV感染引起的免疫缺陷可加速HBV所致的肝病进程(包括肝硬化、肝癌、肝衰竭)，终末性肝病已成为HIV感染者死亡的主要原因，具体机制不明?。 目前已知HBV基因组的PreSS区编码翻译氨基酸的变异引起表位的免疫原性改变，可使病毒逃避宿主的免疫监视而致持续的免疫反应，从而加快肝病进展。 6J。 有报道HIVHBV合并感染者较HBV单一感染者外周血中HBV DNA有较高频率的PreS区缺失突变“。 ，合并HIV感染造成的免疫缺陷是否影响HBV PreSS区抗原表位变异进而与其肝病进程加快相关未见文献报道。 因此本研究拟以HBV单一感染为对照，在获得HBVPreSS区基因序列的基础上，研究HIVHBV合并感染者PreSS区抗原表位变异特征，为深入探讨HIVHBV合并感染者后续疾病进展的致病机制提供参考。 1对象与方法11研究对象随机选取xx年1月份至xx年12月份广州市第八人民医院感染病中心收治的慢性HBV感染者。 按治疗前HIV抗体检测结果分为HIVHBV合并感染组、HBV单一感染组。 所有患者均进行乙肝血清标记物检测且HBsAg阳性6月确诊慢性HBV感染，所有HIVHBV合并感染者均经过ELISA和蛋白质印记确诊抗HIV阳性。 慢性HBV感染和艾滋病的诊断见参考文献910。 排除标准 (1)已进行抗病毒治疗者； (2)明显的肝硬化、肝癌、肝衰竭者； (3)合并有甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒感染和明显机会性感染者； (4)年龄18岁、孕妇、哺乳期者； (5)HBV DNA载量500拷贝ml。 本研究经医院伦理委员会审查和批准并获得患者的知情同意。 12HBV基因组DNA提取采集患者抗病毒治疗前血液，用EDTA抗凝管收集，3000Xg离心10min，取上清液，一80保存备用。 按照QIAampDNA miniKit(德国Qiagen公司)试剂说明书，提取DNA，紫外分光光度计检测DNA浓度。 13病毒DNA片段扩增和序列测定以HBV基因组DNA为模板巢式PCR扩增PreSS区。 PCR第一轮反应正向引物57一GTTCATGTCCWACTGTTCAAGCCTCCAAG一3；反向弓l物57GTTGCATGGTGcTGGTGMRcAGAAA一3，扩增条件95预变性2rain；95cC变性30s，退火6030s，延伸723rain20s(循环30次)；延伸727rain。 万方数据空堡塞堕塑!l竖丛堑生堂盘查!堡!笙!鲞箜!塑竺坠!竺!业n!i r生!卫!l!塑!j!PCR第二轮反应正向引物57一GGTCTFRCATAAGAGGACTCTTGGACT一3；反向引物5CAGACCAATTTAT GCCTACAGCC7FCC一3，扩增条件95预变性2rain；95变性30S，退火6030S，延伸723rain20S(循环35次)；延伸727rain。 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳确认后送Invittogen公司进行测序，测序方法为Sanger法。 14PreSS序列拼接和序列变异分析采用ContigExpress软件进行序列、拼接，BioEdit软件对拼接序列进行比对，将每个序列与GenBank数据库中相应基因型的野生病毒株氨基酸序列进行比较分析，计数含有表位变异的序列数。 参考株序列号B1D00329；B2AFl21249；B3M54923；B4AY033072B5AB219429；C lAY057947；C2AY217378C3X75665；C4AB048705；C5AB24ll11。 HBVPreSS抗原表位CTI细胞表位PreSl aa2l一 28、PreS2aal 15、PreS2aa44 53、Saal4 22、S aa41 49、S aa95一 109、S aal50一 158、S aal90一 197、S aal96206；B细胞表位PreSl aa27 35、PreSl aa37 46、PreS1aa41 54、PreS1aa72 78、PreS1aa93 105、PreSl aal07 118、PreS2aal一 26、S aa93一 106、Saal06 130、S aal24147；Th细胞表位PreSl aa29 48、PreSlaa93 117、PreS2aa29 48、S aal7 31、Saa37 51、S aa67 81、S aal39 146、S aal65 179、S8a176190。 抗原表位见参考文献1112。 15统计学方法采用sPSSl90软件进行统计学分析。 定量资料以KolonmgotOVSmirnov法进行正态性检验，符合正态分布采用均值标准差描述集中趋势，不符合正态分布以中位数(四分位数间距)描述集中趋势；两组间比较采用Wilcoxon秩和检验。 定性资料采川卡方检验或Fisher精确概率检验。 P005)。 22抗原表位变异分析结果HBV PreSS l义i所有CTL细胞表位比较，HIVHBV合并感染组比HBV单一感染组变异发生率整体偏高，其中Ptes2aal一15表位比较具有统计学意义(x2=6964，P=0008)j HIVHBV合并感染组PIes2aal一15位点变异有M1T(22)、M1I(44)、Q2K(44)、S5K(55)、T6N(22)、F6P(22)、T7I(22)、19Q(11)、QlOK(65)、QlOR(33)、T11A(33)、Q13I。 (44)，HIVHBV合并感染组Pres2aal15表位变异中缺失率高于HBV单一感染组(111VS33；x2=2959，P=0085)。 详见图l。 B细胞表位比较，HIVHBV合并感染组PreS2anl一26表位变异发生率显著高于HBV单一感染组，具有统计学意义(x2=6924，P=0010)，HIVHBV合并感染Pres2aal一26变异位点，除PreS2ao_1一15上述位点变异外，有R16K(44)、A19D(22)、F22V(11)、F22L(33)位点变异，两组间其余B细胞和所有的Thrl1_图l CTL细胞表位变肄发生率的比较Fig1Compal isonof theincidem。 P ofCTL epitopes、m-口万方数据史堡塞堕塑堕鏖堑垂芏苤查!至!旦箜!i鲞箜!塑!垫!堕!垦!P垦!i!鲤!垒P堕!堕!善；r翻“1i-。 _，叠o”百”16000SOoo400030002000iOOooHIVl,SV(x)-nwgOHBV(Xn-60)t1蕾j“1蕾?卜i细胞表位变异发生率比较无统计学意义(P值均O05)。 详见图 2、图3。 3讨论目前用于治疗HIV的高效抗逆转录病毒疗法(HAART)虽可同时抑制患者HIV和HBV复制，但HIVHBV合并感染者长期终末性肝病的风险仍明显增加。 2-4。 HBV基因组突变导致抗原表位中氨基酸序列发生变异，可使HBV逃避免疫监视，加快肝病进展。 54。 本研究结果显示，HIVHBV合并感染组较HBV单一感染组HBV PreSS的CTL细胞表位变异发生率整体偏高。 抗原表位特异性的CTL细胞介导的免疫活动在HBV清除过程中至关重要，Zhang等。 1副通过基于肽库的T细胞应答研究，发现CTL细胞表位变异可显著降低抗HBV免疫活性，与HBV感染所致疾病的严重性相关。 而CTL细胞表位的变异主要发生在免疫清除期，在非活性期和免疫耐受期却不受明显影响“，提示免疫压力对于CTL表位的变异有重要作用。 HIVHBV合并感染者可溶性CDl4(sCDl4)和CCL一2等炎症因子分泌较多，免疫过度的慢性活化“，同时伴随着HIV感染可显著降低胃肠道CD4细胞，增加肠道内微生物的易位。 1?，进而通过胆汁酸代谢产物特异性调节肝内细胞免疫?o。 因此推测HIVHBV合并感染者易发生CTL细胞表位变异，可能是长期宿主压力下的免疫逃避选择结果。 在本研究中，所有的Th细胞表位和除了Pres2aal一26的其他B细胞表位发生率无明显整体差异，这和Mondal等18。 研究结论不完全一致，可能与研究队列规模及HBV基因型不一致有关。 HBV Pres2区是个免疫原性强的表位区域，编码翻译的PreS2多肽具有较强的诱导产生免疫反应的能力。 在本研究中发现CTL细胞的PreS2aal一15表位和B细胞Pres2aal26表位变异发生率在HIVHBV合并感染组显著较高，差异具有统计学意义，表位缺失率比较虽无统计学意义，但结果显示HIVHBV合并感染者表位缺失率较HBV单一感染者偏高(111VS33；x2=2959，P=0085)。 研究报道，PreS2多肽具有保持核衣壳结合位点与S蛋白第一个跨膜区域(TM1Sig一1)之间空间距离，维持病毒颗粒蛋白构象的作用，影响病毒的组装和跨膜过程1?，PreS2缺失可产生大量的截短的LHBsAg蛋白，滞留形成毛玻璃样肝细胞(GGH)，发生内质网应激(ER stress)而使DNA氧万方数据史堡塞墅塑堕压堑垂堂苤查垫!至!旦筮!鲞箜!塑垦!i!塑!垦翌竺!i!型!垒P型!j堕!化损伤增加，从而刺激肿瘤相关基因异常表达旧?。 Li等“71研究报道与肝癌进展相关的Pre-S缺失、1762T1764A突变，HIVHBV合并感染者较HBV单一感染发生率较高。 Audsley等”o通过HBV全长序列比较，PreS2变异在共感染中更常见。 但这些研究都是基于碱基序列的直接变异分析，涉及抗原表位的研究甚少。 研究发现，PreS2区表位变异明显增多，此研究结果可为进一步探讨HIVHBV合并感染者肝病进展加快的致病机制提供一定的线索。 HIVHBV合并感染者较HBV单一感染者s区表位变异发生率未见明显差异，其中包括a抗原决定簇(S aa124147)，疫苗免疫失活的经典变异无明显差异。 综上所述，本研究发现合并HIV感染可增加HBVPreSS中CTL细胞表位变异，尤其是Pre-S2区5端表位变异，提示HBV的变异与宿主免疫状态相关，为深入研究HIVHBV合并感染的致病机制提供了可靠资料。 利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突作者贡献声明聂源、廖宝林、邓西子、兰芸实验操作、论文撰写；李凌华、高鸣数据、统计学分析；唐小平、蔡卫平、李锋、胡凤玉研究指导；李锋、廖宝林、胡凤玉论文修改、经费支持参考文献1Chen X，He JM，Ding LS，et a1Prevalence ofhepatitis Bvirusand hepatitisC virusin patients with human immunodeficiencyvirus infectionin CentralChinaJArch Virol，xx，158 (9)1889一1894DOI101007s007050131681一z2Kourtis AP，Bulterys M，Hu DJ，et a1HIVHBV coinfectiona globalchallengeJN Engl J Med，xx，366 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