【毕业学位论文】（Word原稿）利用酵母双杂交系统研究感病番茄品种中与Pto互作的基因植物病理学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 利 用酵母双杂交 系统 研究感病番茄品种中与 作 的 基因 to to 要 番茄细菌性斑点病是一种严重影响番茄质量和产量的世界性细菌病害，是由丁香假单胞杆菌番茄致病变种 起的。番茄中的 抗病基因 病原菌的无毒基因 作是研究植物与病原物互作的典型模式系统。本文利用酵母双杂交系统 ，从 感病番茄品种“中蔬四号”中 筛选 与 作的基因。 我们实验室前期研究发现 ， 感番茄细菌性斑点病的番茄 品种 “中蔬四号”中存在与 探讨感病品种有抗病基因而不抗病的原因进行了本试验。一方面能初步了解感病信号传导途径，另一方面也能 了解植物 病原物互作的机理 ， 进一步 阐明抗感病机制。 本文（ 1）根据已知的蕃茄细菌性抗病基因 因序列，合成了上下游引物，通过 ， 将 获得 的 目的片 段构建酵母诱饵表达载体 从而 在酵母双杂交 系统 中表达诱饵融合蛋白。 （ 2）合成了感细菌性斑点病番茄 品种 “中蔬四号”诱导表达的 ds 以 表达猎物文库的融合蛋白。（ 3）将诱饵载体、 ds 猎物载体 转化到感受态的酵母细胞中， 进行酵母双杂交筛选， 初步筛选到与 作的阳性克隆 36 个，根据测序结果将其 分为 16 类，有 8 类与植物中的相应基因序列同源性较高，另外 8 类在没有找到与其同源的序列，为未知功能基因。 对所测序列的结构域及 行 析， 发现 在这 些克隆中有 含有 类结构域 ；所测序列中 5 类含有 （ 4）通过分析，没有发现在抗病品种中与 接互作的 蛋白，另 外有一 阳性 克隆 45C， 与 其同源 性较高的 蛋白对 导的抗病 信号传导途径 起抑制作用 。 推测这可能是感病品种中存在抗病基因而不起作用的原因。（ 5） 建 立 了 号传导途径模型假说 。 关键词 蕃茄细菌性斑点病， 中蔬四号 ，酵母双杂交 933, 978) is a of to 993 is a . to is a of to on on to by we to in in By to in a we in to CR CR a NA to A S4 we We 6 we 6 of in of to a . 录 第一章 引言 . 5 . 5 . 1 . 1 . 1 . 2 . 3 . 4 . 4 . 5 . 6 . 6 . 7 第二章 诱饵载体 . 8 . 8 菌株和质粒 . 8 . 8 . 8 . 8 . 9 . 9 . 11 . 13 果与分析 . 14 . 14 体酶切 . 14 建诱饵载体酶切 . 15 . 15 . 16 第三章 制备感病番茄品种中蔬四号的 ds . 17 . 17 . 17 . 17 茄 ds 成 . 18 . 18 . 18 . 20 . 22 第四章 酵母双杂交筛选与 . 23 . 23 . 23 法及技术路线 . 28 . 29 . 32 . 33 . 33 . 34 . 35 . 37 . 37 . 37 . 37 . 38 V . 38 . 39 . 43 第五章 结论与讨论 . 44 参考文献 . 46 致谢 . 52 作者简介 . 53 第一章 引言 茄细菌性斑点病概述 番茄细菌性斑点病 ， 亦称番茄细菌性叶斑病或斑疹病，是由丁香假单胞杆菌番茄致病变种 简称 起的 (赵廷昌等， 2001)，能够危害番茄的叶、茎、花、叶柄和果实（ 赵廷昌等， 2001；时涛等， 2003）。在番茄的苗期至收获期的整个生长季节造成危害，使番茄 产量受到损失 ， 在果实上的病斑还严重降低了番茄的商品价值。 自 1933 年报道已来，已在美国、意大利、南非、澳大利亚等二十多个国 家和地区发生，该病 在 15 80%以上的相对湿度下发病， 可造成 5 的产量损失（ et 1980）。在我国 1998 1999 年吉林 省 长春市番茄大棚内发现该病，现已漫延到黑龙江和辽宁省以及甘肃、山西、天津等地 的番茄产区 （刘秋等 ， 2002； 时涛等 ，2003），危害日益严重，因此如何经济有效的防治这种病害的问题 有 待解决。目前 选育与推广 抗病品种是防治此病害最经济有效的措施。 体短杆状，直或稍弯，单细胞，大小为 4 1 微米， 革兰氏阴性，在含有蔗糖的培养基上能产生 绿色荧光，菌株超过 41则不能生长（赵廷昌， 2001）。 在着生理小种的分化，现已鉴定出 两个生理小种，即生理小种 0 号和生理小种 1 号。 术不能区分 两个生理小种。病菌分血清学和血清学菌系。菌株的致病性、碳水化合物的利用、噬菌体敏感性和质粒情况具有多样性。菌株的总可溶性蛋中国农业科学院硕士学位论文 引言 1 白电泳图谱也存在很大差异（ et 1996)。 关于该病抗病信号传导途径的研究，目前主要是针对克隆的抗病基因及其下游的信号传导途径展开的（ B, et 1999） 。抗病基因 别 病原菌的无毒基因后，在其下游一系列的信号传导元件的参与下产生抗病性反应。因此 ,对抗病基因的研究将会进一步明确抗病反应如何发生，进而能充分利用抗性资源，有效的防治该病。 茄细菌性斑点病抗病信号传导途径的研究进展 茄细菌性斑点病抗病基因 茄抗细菌斑点病基因 从野生的番茄品种 引进到栽培品种中的，为单基因半显性遗传，位于第五条染色体上的 间（ et 1984）。 番茄中的抗病基因 病原菌的无毒基因 作是研究植物与病原物互作的典型模式系统。 1993 年 ， 图位克隆的方法克隆了番茄细菌性斑点病的抗性基因 因 是符合基因对基因学说而克隆的第一个植物抗病基因（ et 1993） 。该基因的克隆使得寄主与病原物互作的分子机理研究得到迅速的发展。研究发现该基因编码一个 具有 321 个氨基酸组成的蛋白质，主要能形成带有丝氨酸 苏氨酸激酶催化域，并且位于细胞质中（ et 1999； et 1989；张祥喜等， 2003）。 在细胞质中， 够识别通过型分泌系统分泌到细胞质中的无毒蛋白 激活了对侵入的不同病原物的不同防御反应。也就是说 ， 即使在对没有 且增加 言之 ， 增加 而增加了植物细胞中受到带有无毒基因 量（ et 1999)。 研究发现 ， 因属于成簇的基因家族中的一个成员 （ 董继新等 2001； et 1997） 。在 6R 品种中 因位点由 因和六个 的 括 因 （ et 1994） 。研究表明 因位点是组成型的，在抗病品种和感病品种中都存在 （ et 1993） ，并且都能发生转录，到目前为止 ， 还没有实验证明它是由病原物的侵入诱导而产生的 （ et 1997； et 2001； et 2002； et 2003） 。 因是 因介导的产生对细菌性斑点病抗性和对倍硫磷敏感性所必需的 (et 1994,1996)。该基因位于 因簇内，具有保守性。主要在 径的早期起作用（ et 2003）。 因是对倍硫磷敏感的基因，紧挨着位于第五条染色体上的 因 ，并与之发生共分离。它编码的蛋白质有 80%与 因编码的蛋白质相同（ et 1999）。 原物的无毒基因 般来说 ， 植物的抗性蛋白与病原物的无毒蛋白发生特异性互作是产生抗病性所必 需的，并且这种抗病反应大多与过敏性坏死反应（ 联系 （ et 1996）。抗细菌性斑点病的番茄中，抗性蛋白 过识别病原菌的无毒蛋白 产生对细中国农业科学院硕士学位论文 引言 2 菌性斑点病的抗性。在酵母双杂交 实验 中，番茄的 抗性蛋白 毒蛋白 中 在与 作过程中 ， 酶的第 204 位点上的苏氨酸起了一个关键性的作用 (et 1998)，而第 129et 1996)。另外 ， 还发现 由无毒的 0 号小种的菌株产生的 （ et 1992） ，因此表达 因的番茄对 0 号小种的病原菌产生抗性。而有毒的 1 号小种的菌株不能够产生被 因识别的无毒基因而发病。 实验表明 ， 因编码一个小的亲水蛋白质（ 这个蛋白对没有 抗病基因植物具有毒性。当带有 菌株侵染一个不具有 植物时，细菌的生长加快（ et 2000； et 2000） 。克隆 因，并对 端的氨基酸残基进行鉴定，发现 能攻击植物的细胞膜 （ et 1999） 。 另外 ， 通过酵母双杂交系统，从 株中筛选出与 作的另一个蛋白质et 2002） 。它通过 产生 细胞程序性坏死的抑制子，来提高细菌毒性，增加植物感病性 (et 2003 )。在番茄中 能激起 导的防御反应仅有的无毒基因。进一步的实验还表明， 表达 番茄中表现出过多的无毒活性，而在感病品种中具有累加 的毒力活性 (et 2005)。 茄中与 作蛋白的研究 植物的抗病反应是在许多其它元件共同参与下完成的，因此 ， 在对番茄细菌性斑点病的抗性反应的研究中，与 作的蛋白质的研究也成为必不可少的一部分。用酵母双杂交的方法，以 为诱饵蛋白，以番茄的 库作为猎物，筛选在番茄中参与 导的信号传导蛋白 ， 结果有 149 个克隆 能 与 生 互作。 根据它们的核苷酸序列将其分为 10类 （ et 1998） ，其中有四类研究得比较深入，一类是蛋白质磷酸化激酶 外三 类 是与转录相关的因子 ） 。 因 编码一个胞质的蛋白质激酶，在体外通过分子内机制在丝氨酸 /苏氨酸残基上发生自动磷酸化 （ et 1995） 。 为 一个特殊的底物，是 导的级联磷酸化的一个下游元件，直接被 酸化，并且能加强对表达 原细菌的识别，最终产生过敏性坏死反应和诱导防御基因的表达 （ et 1998） 。当转 因的烟草受到表达 侵染 时，过敏性坏死反应加强，这能有利地说明 病害反应所起的作用 (et 1997； et 1995） 。 类 蛋白质分别含有 234， 168， 248 个氨基酸残基 ， 编码它们的基因本身具有转录活性的结构域。通过序列分析，发现 （ 合蛋白的序列具有同源性，位于细胞核内 （ et 1997； et 2000） ，并且含有一个与 作的高度保守的 合域 (et 1997） 。实验表明 别， 与其互作的 （ et 1997） ，在植物与病原物不亲和互作的过程中调节这些基因的表达， 使植物 获得系统抗性 （ et 1991） 。另外 （ et 1997）。当番茄受到 染和用不同的信号分子处理后 ，在不同的番茄组织中 因的表达不同，说明它们 在植物中所起的作用不同（ et 2000）。这些试验 ， 在中国农业科学院硕士学位论文 引言 3 抗病基因和特异的激活植物防御反应基因间建立了直接的联系。 导的番茄细菌性斑点病抗病信号传导途径 植物 抗性基因的产物 识别 病原物 无毒基因产物后 ，进行信号传导可能产生 防御基因的表达，有时这两种途径可以交叉进行 （ et 1997） 。 在 因介导的抗性反应过程中，也存在 防御基因表达这两种途径。首先 ， 丁香假单胞菌通过型分泌系统将 入到植物细胞中 （ et 1996； et 1996） , 互作使带有 因的植物对带有 因的假单胞菌产生识别。这种识别可能有 参与，使 酶磷酸化，激活在抗病性反应中起作用的下游靶蛋白。然后可能发生抗性反应的两种途径，一种是下游的 酸化产生 一种是 ，诱导防御基因的表达 （ et 1998） 。 导的抗性反应中心内容为 力攻击的目标， 有识别 ，才能互 相结合，激活下游的一系列信号传导元件，产生相应的抗病性反应 （ et 2004； 韩俊德等 ， 2005） 。 关于 导的抗病反应的模型目前主要有两种假说（见图 1一种是亲和力加强模型。提出植物的细胞中存在一定比例的 基本防卫反应中发挥 作用 。这个复合物与 结合 ， 激活了 酶的活性 ， 或是增强了这个复合物的稳定性，从而使其在细胞中的含量增加，进而加强了基本的防御反应。所以 ， 提出 增强并稳定已存在的 合物，最终激起 抗病性反应 (et 1998)。其中 ， 有试验阐明了激酶的活性是产生过敏性坏死反应所必须的 （ et 1999； et 2000） 。 含 病原物产生抗性 ， 需要 有 与其互作的蛋白质 与 ，但它们不是产生基因对基因学说抗性所必 需 的。 第二个模型是防卫反应模型，即 基本的防卫反应发挥作用（ et 1998； et 2001） 。 结合干扰了 活性，破坏了它的功能，使得病原菌无致病性。这个模型的中心内容 为 力的攻击目标 ， 为检测病原菌入侵的一个信号，监测 互作 （ et 1996； et 1998； et 2000） 。这种防卫反应在寄主中都存在，但是 个现象也是这个模型无法解释的。 中国农业科学院硕士学位论文 引言 4 图 1 导的抗病性反应模型 绿色的箭头表示与诱导过程相关的基因，红色的箭头表示受 到抑制的基因，黑色的箭头表示信号传导过程中可能的途径。 in of a ,K ),or 母双杂交系统 母双杂交系统简介 酵母双杂交系统（ (et 2004； et 2001；et 2000； et 2000） 是 1989 年 立的，用来研究蛋白质与蛋白质之间相互作用的简便而有效的方法 (et 1989)。近几年发展的 新系统主要对报告基因、 诱饵 表达载体以及 猎物 表达载体等做了一些改进 而 得到了广泛运用 (敖光明等，2001)。酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。大量的研究表明，酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组 编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作 (朱金鑫等 2004；王关林等， 2002）。 酵母双杂交系统 用来研究蛋白质与蛋白质之间的互作 。 目前 ， 主要应用于以下四个方面：发现新的蛋白质和蛋白质的新功能；在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用；筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响；建立基因组蛋白连锁图（ 吴乃虎 ,1998)。其中 ， 最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基 因。 酵母双杂交系统检测蛋白之间的相互作用 ， 具有以下优点 (et 1995)： (1)作用信中国农业科学院硕士学位论文 引言 5 号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。 (2)检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况 。（ 3） 检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。 （ 4） 酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建 库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白 。 母 双杂交系统原理 酵母双杂交系统的建立是以真核细胞转录激活因子的结构和活性为基础的（杨齐衡，1999）。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与，真核细胞转录激活因子的结构基本相似，往往由两个或两个以上结构上可以分开、功能上相互独立的结构域构成，其中有合功能域 (转录激活结构域（ 这两个结构域在它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈 现完整的 录因子活性，并可激活上游激活序列（ 的下游启动子，使启动子下游基因得到转录 （ 吴乃虎等， 1998；宫明等 2000） 。根据这个特性，分别构建含 将 融合，构建出 库，基因片段或基因突变体（以 Y 表示）融合，构建出 粒载体。两个穿梭质粒载体共转化至酵母体内进行表达。该酵母菌株含有特定报告基因（如 ） ，并且本身无报告基因的转录活性。 因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。 蛋白质 X 和 Y 的相互作用导致了 空间上的接近，从而激活 游启动子调节的报告基因的表达，使转化体由于 达而 能够 在特定的 营养 缺陷培养基上生长。 从而通过功能互补和显色反应筛选到菌落。将阳性反应的酵母菌落 中的 体提取分离出来，从而对载体中插入的文库基因进行测序和分析工作 (et 原理如图 1 动 子 告基因 Y 动 子 告基因 D 中国农业科学院硕士学位论文 引言 6 图 1母双杂交原理图 of 本实验所用的酵母双杂交系统特点 本试验所用的试剂盒 成技术统一起来，使得用来构建酵母双杂交的 库大大简化。在这个 试剂盒中，诱饵基因与 体 合表达，而另一个基因或 库与 体 行融合表达。当诱饵和文库的融合蛋白在酵母的报告菌株 发生互作时能够激活报告基因 转录。原理如图 1 图 1D 理 D 用这个试剂盒进行双杂交筛选时，把 合成的 ds 隆到 体 将该克隆在体外共转化。这个过程在酵母中利用高效的重组系统， ds 适当的D 质粒相融合。使文库的构建和筛选能够很快的完成，而不用经过细菌的转化和扩增步骤。 试验的前期基础 1998 ， 在我国的吉林省、辽宁省、黑龙江省等地的大棚番茄上发现了番茄细菌性斑点病，并从病斑上分离了病原菌，对病原菌进行了鉴定，确认该病原菌为丁香假单胞杆菌番茄致病变种（赵廷昌， 2001）。 1997)报道 ， 在感 细菌性 斑点病和 对 倍硫磷不敏感的番茄品种（ 存在 位基因得到分离和特性测定，发现其编码活性蛋白激酶，和 基酸序列同源性为 87 (et 我们实验室从感病番茄品种“中蔬四号”和 “ 中分离到和抗病基因序列完全一致的克隆，表明在我国的感病番茄品种中也存在抗病基因的同源序列 (赵廷昌等， 2004） ，这一点也和 et 1996） 。 研究结果推测 ， 单独的抗病基因序列是不能够导致抗病反应 的， 动 子 告基因 转录 Y D 中国农业科学院硕士学位论文 引言 7 必须和相关的一系列基因共同作用才能产生抗病反应。也就是说 ， 通常所说的植物的抗病基因与病原物的无毒基因互作产生的，更准确的说 ， 应该是许多病原物与植物蛋白质其同参与的 ， 基因组对基因组的互作 （ et 这 为 我们进行抗病性的研究提供更广阔的思路。 研究的目的与意义 番茄细菌性斑点病 （ ，是一种严重影响番茄产量和品质的世界性重要病害，并且 番茄相互作用是研究病原 物 与寄主互作的 典型 模 式 系统。因此对该病的研究十分关注， 尤其是 在 病原菌 与 寄主互作和抗病信号传导方面的研究取得很大的进展 。 2002 年，我们实验室根据 因的序列，设计引物，用 法从我国的番茄品种中分离 因的类似序列 。 结果表明有两个抗病番茄品种带有 因， 8个抗病品种带有同源性最低为 91%的同源序列，有两个感病品种也带有与 因序列完全 一致的序列。用同样的方法也获得了 因的同源序列，与 源性达 98 99 ，带有 列 (一致 )的 4个品种的 列与已经报道的 列同源性为 98 (时涛等 ,2002）。 番茄互作的研究已经有很多报道，抗病基因在信号传导方面的研究如上所述也 取得 很多进展，而在感病番茄品种存在的抗病基因序列为何没有抗病作用？在感病品种中与抗病基因直接互作的基因是否与抗病品种中的相同？至今还没有这方面的研究报道。我们拟开展感病番茄品种中与 作基因的研究，即利用酵母双杂交技术，从感病番茄品种中筛选出与抗病基因 作的 因，然 后和在抗病品种中与 作的基因比较，以研究 因在感病番茄品种中的最初受体，从信号传导方面一步一步探索寻找感病品种中有抗病 列而不起抗病作用的原因。研究结果对丰富植物的抗感病机理、抗感病信号传导、指导抗病基因的利用具有重要的科学意义。 中国农业科学 院硕士学位论文 诱饵载体 构建及验证 8 第二章 诱饵载体 构建及验证 酵母双杂交实验的一个关键步骤是构建诱饵载体，即将已知的外源基因构建到 结合域上，并产生有活力而没有毒力的融合蛋白。本章主要是将 成诱饵载体构建。 料 株和质粒 实验所用菌株和质粒如表 2 表 2菌菌株和质粒 菌株 /质粒 相关特征 本研究用途 来源 80 粒转化宿主菌 中国农大王俊果博士提供 质粒转化宿主菌 本实验室提供 性标记， 养标记，表达 合蛋白 构建诱饵载体 购自 司见图 2 培养基 养基：蛋白胨 10 g，酵母粉 5 g， 0g， 10 M 馏水 1000 到 固体培养基中应加入 15 g 琼脂。 养液： 2 胰蛋白胨， 酵母 粉 ， 10 2.5 20 液 （ 1 M 1 M 20 萄糖（ 液和葡 萄糖要过滤 除 菌